An experimental approach to probe conformational changes in proteinstructure using a biotin derivative followed by mass spectrometry

Das Biotinylierungsmuster zweier löslicher Proteine (BSA und CA II), sowie das des Erythrozytenmembranproteins Bande III wurde unter unterschiedlichen Bedingungen analysiert. Im ersten Schritt wurden diese Proteine mit einem Überschuss an Biotin in einem molaren Verhältnis biotinyliert. Für die löslichen Proteine führt eine Erhöhung der Biotinkonzentration zu einer Zunahme der Anzahl an biotinylierten Lysinresten bis zu einem Punkt der Sättigung. Eine weitere Erhöhung der Biotinkonzentration führt nicht zu zusätzlich mit Biotin markierten Lysinresten. Das Biotinylierungsmuster dieser beiden löslichen Proteine ist reproduzierbar und zeigt unter allen gewählten Bedingungen eine Biotinylierung spezifischer Lysinreste. Nachdem gezeigt war, dass die Biotinylierung der Proteine spezifisch und reproduzierbar ist, wurde die gleiche Methode gewählt, um künstlich verursachte Konformationsänderungen in BSA und CA II anhand eines veränderten Biotinylierungsmusters zu zeigen. Diese Proteine wurden erhöhten Temperaturen ausgesetzt, um eine Konformationsänderung hervorzurufen, und anschliessend wurden die Biotinylierungsmuster bei Raumtemperatur und 80 °C miteinander verglichen. Bei BSA führt die Erhitzung auf 80 °C zu einer Biotinylierung von zwei zusätzlichen Lysinresten. Dabei ist es wahrscheinlich, dass die durch die Erwärmung verursachte Konformationsänderung die beobachtete Änderung des Biotinylierungsmusters zur Folge hat. Im Fall von CA II gibt es keinen Unterschied das Biotinylierungsmusters zwischen Raumtemperatur und 80 °C. Da es Hinweise dafür gibt, dass sich die Konformation des Bande III Proteins in der Plasmamembran von Erythrozyten nach einer Infektion mit P. falciparum verändert, wurden intakte infizierte und nichtinfizierte Erythrozyten biotinyliert, um etwaige Unterschiede in den Biotinylierungsmustern festzustellen. Das Biotinylierungsmuster des Proteins unterschied sich zwischen RBC und IRBC nur in einem einzelnen Lysinrest, der nur in RBC biotinyliert ist. Diese Beobachtung bestätigt die Annahme, dass Bande III nach der Infektion durch P. falciparum eine Konformationsänderung erfährt und erlaubt es, die Position dieser Veränderung einzugrenzen.