Modified Poly(ethylene imines) for plasmid delivery: Physico-chemical and in vitro/in vivo investigations

In der vorliegenden Dissertation wird die Entwicklung von Polyethylenimin (PEI) - Konjugate als Vektoren zur Verabreichung von Plasmiden beschrieben. Die hergestellten Konjugate wurden charakterisiert und auf ihre Eignung als nicht-virale Vektoren für die in vivo-Anwendung untersucht. Kapitel 1 gibt eine einleitende, detaillierte Übersicht über den aktuellen Status polykationischer Gentransfersysteme basierend auf PEI und PEI-Derivaten. Grundlegendes Wissen über PEI-basierte Vektoren wird vermittelt und die Spannbreite an PEI-Modifikationen, die derzeit untersucht werden, wird beschrieben. In Kapitel 2 wird ein neuartiger Gentransfervektor für die Lungnenadministration untersucht. Das Konjugat basiert auf einer vom HIV TAT-Peptid abgeleiteten Proteintransduktionsdomäne, die über einen Polyethylenglykol (PEG)-Linker an verzweigtes PEI gekoppelt wurde. Von der HIV TAT-Proteintransduktionsdomäne wird vermutet, dass sie einen direkten Übergang über biologische Membranen ermöglichen kann. Wir vermuteten deshalb, dass sie ebenfalls die Zellaufnahme von Plasmid-DNA in der Lunge erhöhen könnte. Das neue Konjugat bildete sehr kleine und stabile Partikel, günstig für die Anwendung über die Luftwege. Die Genexpression mittels TAT-PEG-PEI in der Mauslunge lag 600% über der von unmodifiziertem PEI. Weiterhin wurden nur minimale Auswirkungen auf die Lungenfunktion beobachtet, ebenso keinerlei zusätzliche entzündliche Reaktionen im Vergleich zur reinen Plasmidinstillation. Ein besonderer Vorteil dieses Trägersystems stellt seine Fähigkeit dar, DNA sicher in verschiedene Lungenzelltypen zu transportieren. In Kapitel 3 wird die Entwicklung von stabilisierten Polyplexes auf Basis von hochmolekularem (HMW) und niedermolekularem (LMW) PEI beschrieben. Die Polyplexe wurden im Hinblick auf den Einfluss des Molekulargewichtes sowie der Formulierung untersucht. Theoretisch sollte die Quervernetzung der primären Amine in PEI zu einer erhöhten Polyplexstabilität führen, die sie geeignet machen würde zur intravenösen Verabreichung. Die Polymere wurden mit einem homobifunktionellen Linker quervernetzt, der eine auf das Redoxpotential ansprechende Disulfid-Gruppe enthält. Zwei unterschiedliche Formulierungsstrategien wurden untersucht. Nur durch Quervernetzen der fertig gebildeten Polyplexe wurde eine erhöhte Widerstandsfähigkeit gegen Polyanion-Austauschreaktionen und hohe Ionenstärken erreicht. Des Weiteren waren bei diesen Polyplexen Wechselwirkungen mit wichtigen Blutkomponenten wie Albumin und Erythrocyten deutlich verringert. Diese Ergebnisse zeigen den Einfluss des PEI Molekulargewichts und der Formulierungsstrategie auf die Herstellung stabilisierter Vektoren. In Kapitel 4 wurden die bioreversibel quervernetzten HMW PEI-Polyplexe detaillierter untersucht. Wir postulierten, dass die intrazellulären Redoxbedingungen, die hauptsächlich durch den Glutathionstatus bestimmt werden, das Freisetzungsverhalten der DNA aus den Polyplexen und damit die Transfektionseffizienz beeinflussen würden. In der Tat waren die eingeführten bioabbaubaren Disulfidbindungen empfindlich gegenüber reduzierenden Bedingungen. Die Pharmakokinetikprofile der PEI/Plasmid-Polyplexe in Mäusen nach intravenöser Injektion zeigten erhöhte Blutwerte für die quervernetzten Polyplexe, was auf eine erfolgreiche Stabilisierung hinweist. Die unerwünschte Lungentransfektion wurde signifikant reduziert, während die Transfektion in der Leber auf hohen Werten erhalten blieb. Diese Untersuchungen legen nahe, dass quervernetzte Polyplexe stabiler in Zirkulation sind und ihre Transfektionseffizienz nach intravenöser Injektion erhalten. Allerdings scheint eine sorgfältige Einstellung des Stabilisierungsgrades notwendig zu sein. In Kapitel 5 wurden die Konzepte der Oberflächenstabilisierung sowie der Abschirmung mittels PEG kombiniert. Wir vermuteten, dass die Kombination aus Ladungs- und sterischer Abschirmung durch PEGylierung mit Oberflächenquervernetzung die Stabilität der Polyplexe und ihre Zirkulationszeiten weiter erhöhen würde. Zellkulturexperimente machten die hohe Transfektionseffizienz der Copolymerpolyplexe deutlich, die bis zu 5-fach höher lag als die von PEI bei den Copolymeren mit 30 kDa PEG. Nach intravenöser Injektion in Mäuse zeigten die Plasmide, die mit PEI-PEG(30k) mit nur einer PEG Kette komplexiert waren, höhere Blutwerte, was auf eine erfolgreiche Abschirmung der Polyplexe hinweist durch PEG. Diese Polyplexe wurden durch Oberflächenquervernetzung mit DSP stabilisiert. Tatsächlich konnten so die Blutspiegel nochmals erhöht werden im Vergleich zu PEI, bis zu 125% höher direkt nach Injektion. Die Werte blieben erhöht bis 60 min nach Injektion. Diese Ergebnisse betonen, dass eine kombinierte Strategie zur Formulierung stabiler Vektorsysteme für die intravenöse Anwendung möglich und zugleich viel versprechend ist für eine systemische Anwendung.