RNAi im Hochdurchsatzverfahren - Identifikation potentieller Angriffspunkte zur Überwindung der Toleranz gegenüber dem niedermolekularen Wirkstoff RITA in H460 NSCLC-Zellen
Der niedermolekulare Wirkstoff RITA wurde 2004 erstmals als potenzielles Krebsmedikament beschrieben. Er wurde hier zunächst als p53-Wildtyp-Reaktivator, dessen Funktion eine Blockade der p53-MDM2-Interaktion zu Grunde liegt, charakterisiert. In den folgenden Jahren konnte jedoch ebenfalls eine Wirk...
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| 1. Verfasser: | |
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| Beteiligte: | |
| Format: | Dissertation |
| Sprache: | Deutsch |
| Veröffentlicht: |
Philipps-Universität Marburg
2023
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| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | PDF-Volltext |
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| Zusammenfassung: | Der niedermolekulare Wirkstoff RITA wurde 2004 erstmals als potenzielles Krebsmedikament beschrieben. Er wurde hier zunächst als p53-Wildtyp-Reaktivator, dessen Funktion eine Blockade der p53-MDM2-Interaktion zu Grunde liegt, charakterisiert. In den folgenden Jahren konnte jedoch ebenfalls eine Wirkung von RITA auf p53-mutierte Tumorzellen gezeigt werden und aktuellere Forschungsergebnisse legen letztendlich eher einen p53-unabhängigen Wirkungsmechanismus als DNA-Vernetzer nahe.
In der vorliegenden Arbeit wurden RITA-tolerante Zellklone einer WT-p53-tragenden, primär RITA-sensiblen NSCLC-Zelllinie (H460) mittels RNAi untersucht. Ziel war es, Gene zu finden, deren Knockdown zu einer Resensitivierung der toleranten Zellen gegenüber RITA führt.
Auf Grund der angenommenen genotoxischen Eigenschaften von RITA, wurde eine siRNA-Bibliothek von Genen der DNA-Schadens-Antwort getestet. Dabei konnte RAD18 als „Hit“ identifiziert werden. Sowohl mittels kurzfristigem siRNA-Knockdown, als auch im längerfristigen shRNA-Knockdown von RAD18 konnte eine Resensitivierung der toleranten H460-Zellen gegenüber RITA erreicht werden. Es konnte damit gezeigt werden, dass es sich um eine potenziell reversible Toleranz handelt. Dass es sich hierbei außerdem um ein Gen mit Funktionen in der DNA-Schadens-Toleranz handelt, unterstützt die Beschreibung von RITA als primären DNA-Vernetzer/Wirkstoff mit primär genotoxischer Aktivität. Daneben konnte Wanzel et al. (2016) zeigen, dass der Knockdown von FancD2 ebenso wie der von RAD18 zu einer Resensitivierung der toleranten Zellen gegenüber RITA führt. Eine Verbindung zwischen FancD2 (einem Gen des Fanconi-Anämie-Signalweges) und RAD18 wurden in der Literatur bereits diskutiert. Somit lässt sich vermuten, dass RAD18 für den Toleranzmechanismus in seiner Verbindung zum FA-Signalweg, in der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen eine Rolle spielt.
Weiterhin wurde ein Microarray zum Vergleich der Genexpression von RITA-toleranten und parentalen H460-Zellen durchgeführt, um in den RITA toleranten Zellen vermehrt exprimierte Gene zu identifizieren. Hierbei konnten die Gene SOX2, INHBA und FST als in den toleranten Zellen als Heraufreguliert validiert werden. Durch einen Knockdown dieser Gene mittels RNAi durch siRNAs konnte jedoch keine eindeutige Resensitivierung gegenüber RITA erreicht werden. Die stark vermehrte Expression von SOX2 fügt den toleranten Zellen jedoch einen weiteren Stammzellmarker (neben bereits gezeigter Sphärenbildung und CD133-Positivität) hinzu.
Die Ergebnisse zeigen daher, dass es sich bei den RITA-toleranten Zellen um Subpopulationen von H460-Zellen mit Stammzellcharakteristika und potenziell überwindbarer RITA-Resistenz auf dem Boden einer veränderten DNA-Schadens-Antwort handelt, sodass hier der Vergleich zu den sogenannten DTPs (drug tolerant persisters) nahe liegt. Als DTPs werden Krebszellen bezeichnet, die sich in einem transienten Zustand der Apoptose-Resistenz sowie des „slow cyclings“ befinden und Tumorstammzellcharakteristika zeigen. Sie stehen klinisch in Verbindung mit Therapie-Resistenz und Rezidiven, sodass hier großes Interesse besteht diese Zellen anvisieren zu können. Mit RAD18 in Verbindung mit dem FA-Signalweg wurden hier potenzielle Angriffspunkte aufgezeigt. |
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| Umfang: | 107 Seiten |
| DOI: | 10.17192/z2023.0419 |