Struktur- und Funktionsanalyse der Protein-basierten RNase P des hyperthermophilen Bakteriums Aquifex aeolicus und homologer Enzyme

Die Reifung einer transfer-RNA (tRNA) ist ein essenzieller Schritt in der Proteinbiosynthese in allen drei Domänen des Lebens. Dabei sind mehrere Schritte notwendig, um von einer Vorläufer- zu einer maturen tRNA zu gelangen. Die Spaltung der 5‘-Flanke wird einzig durch die Ribonuklease P (RNase P) v...

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Main Author: Wäber, Nadine Bianca
Contributors: Hartmann, Roland K. (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2019
Pharmazeutische Chemie
Subjects:
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:Die Reifung einer transfer-RNA (tRNA) ist ein essenzieller Schritt in der Proteinbiosynthese in allen drei Domänen des Lebens. Dabei sind mehrere Schritte notwendig, um von einer Vorläufer- zu einer maturen tRNA zu gelangen. Die Spaltung der 5‘-Flanke wird einzig durch die Ribonuklease P (RNase P) vermittelt. Es gibt zwei Arten der RNase P, die eine besteht aus einem mit ein bis zehn Proteinuntereinheiten assemblierten Ribozym, die andere ist eine rein Protein-basierte Form (PRORP), welche zunächst nur in Eukaryonten identifiziert wurde. Das Ribozym konnte in allen drei Domänen des Lebens nachgewiesen werden. Im Kontext dieser Arbeit wurde eine neue Art der Protein-basierten RNase P (AaRP) in dem hyperthermophilen Bakterium Aquifex aeolicus charakterisiert. Im Gegensatz zu den bereits bekannten etwa 60 kDa großen Enzymen aus Pflanzen ist dieses Protein deutlich kleiner (~23 kDa) und weist erkennbar nur eine katalytische Domäne auf. Substratbindungsdomänen konnten nicht bioinformatisch nicht identifiziert werden. Das aktive Zentrum konnte durch gezielte Mutationsanalysen charakterisiert sowie die enzymatische Aktivität in vitro nachgewiesen werden. Zusätzlich konnte in Kooperation mit einer Wiener Arbeitsgruppe in zwei unabhängigen in vivo Experimenten gezeigt werden, dass AaRP in der Lage ist sowohl die endogene RNase P von E. coli (eine RNA plus eine Proteinuntereinheit), als auch die komplexere Form der Bäckerhefe (eine RNA plus neun Proteinuntereinheiten) funktional zu ersetzten. Durch bioinformatische Analysen konnten Homologe von AaRP (HARP) in Bakterien und Archaeen identifiziert werden. Es wurden insgesamt jeweils fünf bakterielle und archaeale HARPs exemplarisch ausgewählt. Im Gegensatz zu A. aeolicus besitzen alle weiterführend untersuchten Organismen zusätzlich eine RNA-basierte Form der RNase P, welche zum Teil bereits in anderen Publikationen beschrieben wurde. Es zeigte sich, dass die HARPs der Archaeen Methanosarcina mazei, Methanothermobacter thermautotrophicus, sowie Haloferax volcanii ebenfalls die 5‘-Enden von tRNAs prozessieren können. In Kooperation mit einer Ulmer Arbeitsgruppe konnten in H. volcanii Deletionsmutanten des Proteins konstruiert und weiterführend untersucht werden. Durch eine Kooperation mit einer Kieler Arbeitsgruppe konnte dies ebenfalls in M. mazei durchgeführt werden. Bei den bakteriellen HARPs zeigte sich, dass die HARPs von Thermodesulfatator indicus und Methylacidiphilum infernorum ebenfalls dazu in der Lage waren, Prä-tRNAs zu prozessieren. Neben den HARPs wurden auch die RNA-basierten RNase P Enzyme auf ihre tRNA-Prozessierung-Aktivität hin untersucht, insofern diese noch nicht in Veröffentlichungen beschrieben wurde. Im Gegensatz zu AaRP besitzt PRORP eine Pentatricopeptide-repeat-Domäne, welche an der Substrat-Bindung beteiligt ist. Um mehr über die Substratspezifität von AaRP zu erfahren, wurden verschiedene Varianten einer Modell-Prä-tRNA in Spaltungsstudien untersucht. Dabei zeigte sich, dass AaRP sowohl Merkmale einer bakteriellen RNase P als auch einer eukaryotischen Protein-basierten Form aufweist. So spielt beispielsweise, ähnlich zu den bakteriellen RNase P-Enzymen, die Länge der 5‘-Flanke eine Rolle bei der Substraterkennung durch AaRP; dies ist bei den PRORP-Enzymen hingegen irrelevant. Demgegenüber zeigt das 3‘-Ende der Prä-tRNA keine Interaktion mit AaRP oder PRORP, welches bei den RNA-basierten bakteriellen RNase P-Enzymen essenziell ist. Zusätzlich sollte die Struktur von AaRP und H. volcanii HARP aufgeklärt werden, um weitere Einblicke in die Substratbindung zu gewinnen. Während die Kernspinresonanz-Spektroskopie nicht erfolgreich war, konnte mittels Gelfiltration, dynamischer Lichtstreuung und Circulardichroismus-Spektroskopie gezeigt werden, dass AaRP fast ausschließlich α-helikal ist und als großer homooligomerer Komplex (~420 kDa) vorliegt. Das H. volcanii HARP hingegen besitzt mehr β-Faltblatt Anteile und liegt als bedeutend kleinerer Komplex (~90 kDa) vor. Durch analytische Ultrazentrifugation und kryoelektronenmikroskopische Analyse konnte bestimmt werden, dass die Komplexbildung von AaRP ein heterogener Vorgang ist, da sich verschiedene Größen identifizieren ließen. Die Kristallisationsexperimente waren nur bedingt erfolgreich und die erhaltenen Kristalle waren vorwiegend klein. Eine genauere Analyse dieser Kristalle sowie eine Optimierung der Kristallisations-Bedingungen konnte im zeitlichen Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht mehr durchgeführt werden.
Physical Description:216 Pages
DOI:https://doi.org/10.17192/z2019.0537