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Aufreinigung und Charakterisierung der RNase P in Aquifex aeolicus
Die Aufgabe der vorliegenden Arbeit bestand darin, die Ribonuklease P (RNase P) in dem hyperthermophilen Bakterium Aquifex aeolicus mittels eines biochemischen Ansatzes zu identifizieren und zu charakterisieren. Die phylogenetische Einordnung der Gattung Aquifex ist bis heute nicht eindeutig gekl...
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| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Beteiligte: | |
| Format: | Dissertation |
| Sprache: | Deutsch |
| Veröffentlicht: |
Philipps-Universität Marburg
2014
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| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | PDF-Volltext |
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| Zusammenfassung: | Die Aufgabe der vorliegenden Arbeit bestand darin, die Ribonuklease P (RNase P) in dem
hyperthermophilen Bakterium Aquifex aeolicus mittels eines biochemischen Ansatzes zu
identifizieren und zu charakterisieren. Die phylogenetische Einordnung der Gattung Aquifex
ist bis heute nicht eindeutig geklärt und bioinformatische Analysen des A. aeolicus-Genoms
führten nicht zur Identifizierung von Genen für RNase P-Komponenten. Folglich gestaltete
sich die Etablierung einer Aufreinigungs-Methode schwierig, da über die Biochemie der A.
aeolicus RNase P nichts bekannt war. Trotz der schwierigen Ausgangssituation ist es in der
vorliegenden Arbeit gelungen, eine semi-präparative native Aufreinigungsmethode zu
etablieren, die wie angestrebt sowohl effizient als auch reproduzierbar ist. Die Methode
besteht aus drei sukzessiven Aufreinigungsschritten, in denen nach Ladung, Hydrophobizität
und Größe getrennt wird. Dadurch konnte die RNase P-Aktivität stark angereichert und ein
Großteil der Zellkomponenten abgetrennt werden. Anschließend wurde ein Protokoll
entwickelt, mit dem aus den hochaufgereinigten RNase P-aktiven Proben eine separate
Extraktion funktioneller Gesamt-RNA und Gesamt-Protein gelang. Aus diesen RNA- und
Protein-Präparationen konnten erstmals RNase P-aktive Holoenzyme von A. aeolicus in vitro
rekonstituiert werden. Die Rekonstitutionsexperimente belegen eindeutig, dass sowohl eine
RNA- als auch eine Protein-Komponente für die RNase P-Aktivität in A. aeolicus essenziell
ist. Zu Beginn der Arbeit, als die Holoenzymrekonstitution noch nicht entwickelt war, wurde
eine vermeintliche P RNA, die von einer bioinformatischen Expertengruppe (Prof. I.
Hofacker, Universität Wien) als A. aeolicus P RNA vorhergesagt wurde, getestet und auf
experimenteller Basis als RNase P-Komponente ausgeschlossen. Ausführliche kinetische
Untersuchungen ergaben keine Hinweise auf eine Beteiligung der vorgeschlagenen RNAVariante
an der 5´-Prozessierung von Prä-tRNAs. Zudem war die RNA in RNA-Seq-
Bibliotheken praktisch nicht repräsentiert, was gegen ihre Expression spricht.
Zur Ordnung der Aquificales gehören drei Familien: die Desulfurobacteriaceae, die
Hydrogenothermaceae und die Aquificaceae. Bislang wurden RNase P-Enzyme nur in den
sequenzierten Spezies der Desulfurobacteriaceae und der Hydrogenothermaceae gefunden,
nicht aber in der Familie der Aquificaceae, zu denen auch A. aeolicus gehört. Da der
Nachweis von RNase P-Aktivität in Zellfraktionen von A. aeolicus gelang, bioinformatisch
jedoch weder ein bakterientypisches Gen für die RNA- noch für die Protein-Untereinheit der
RNase P gefunden werden konnte, handelt es sich bei dem Enzym in diesem Bakterium mit
hoher Wahrscheinlichkeit um eine unkonventionelle Form der RNase P. Folglich wurde in
den RNase P-angereicherten Fraktionen besonders nach Komponenten gesucht, die
ausschließlich in Aquificaceae, nicht aber in den beiden anderen Familien der Aquificales
vorkommen. Bei der RNA-Seq-Analyse von RNA-Extrakten, die auf RNase P-Aktivität
angereichert worden waren, konnten zwei RNA-Transkripte identifiziert werden, die diesem
Kriterium entsprechen. Die bioinformatische Analyse ergab, dass diese RNA-Varianten nur in
- wenn auch nicht in allen - Aquificaceae-Spezies vorkommen, nicht aber in anderen
Aquificales. Faltungsvorhersagen dieser RNAs ließen jedoch keine markanten strukturellen
Ähnlichkeiten zu klassischen bakteriellen RNase P RNAs erkennen. Die RNA-Seq-Analyse
zeigte zudem, dass parallel zur RNase P-Aktivität eine Anreicherung der 6S RNA und der
16S rRNA stattfindet. Die Anreicherung der 16S rRNA deutet auf eine Assoziation der
RNase P mit der kleinen ribosomalen Untereinheit hin.
Bei der Suche nach den Proteinkomponenten der A. aeolicus RNase P wurde mittels
massenspektrometrischer Analyse sowohl die Identität als auch die Quantität der Proteine in
den hochaufgereinigten Fraktionen mit maximaler RNase P-Aktivität bestimmt. Das Ergebnis
wurde dann mit der Analyse von Fraktionen verglichen, die ansteigende oder abnehmende
Enzymaktivität aufwiesen. Parallel dazu wurden auch RNase P-aktive Fraktionen
entsprechend ihrer Elution beim 3. Aufreinigungsschritt auf einem SDS-Gradientengel
aufgetrennt. Einzelne Proteinbanden, die gut mit der RNase P-Aktivität korrelieren, wurden
daraufhin ausgeschnitten und ebenfalls einer massenspektrometrischen Analyse
unterworfen. Durch einen Vergleich der Ergebnisse aller Analysen konnte ein 22,5 kDa
Protein identifiziert werden (aq_880), das signifikant in hochaufgereinigten Proben mit
maximaler RNase P-Aktivität vorhanden war. Bioinformatische Struktur- und
Domänenvorhersagen ergaben, dass dieses Protein viele gestellte Suchkriterien erfüllt. So
weist das Protein eine RNA-bindene Domäne auf, die zur Bindung des Prä-tRNA-Substrats
bzw. einer RNA-Komponente erforderlich ist. Weiter wird dem Protein aufgrund einer
vorhergesagten PIN-Domäne eine Endonuklease-Aktivität zugeschrieben. Solch eine
Proteinfunktion wäre mit den Anforderungen an eine nicht kanonische bakterielle RNase P
durchaus vereinbar. Die PIN-Domäne ist bei den erst kürzlich identifizierten PRORPEnzymen,
also den eukaryontischen Protein-basierten RNase P-Enzymen, nachweislich die
katalytische Metallonuklease-Domäne. Zudem handelt es sich bei dem identifizierten
aq_880-Protein um ein hypothetisches Protein unbekannter Funktion, das ausschließlich in
den Aquificaceae vorkommt, nicht aber in den Desulfurobacteriaceae und
Hydrogenothermaceae. Neben dem aq_880-Protein wurden in Fraktionen mit hoch
aufgereinigter RNase P-Aktivität fünf weitere Proteine mit einer deutlichen, aber im Vergleich
zu aq_880 geringeren Signifikanz angereichert. Dabei handelt es sich um das hypothetische
Protein aq_707, das Strukturvorhersagen zufolge partiell mit dem bifunktionellen tRNAModifikations-
Enzym MnmC aus E. coli übereinstimmt und demzufolge an der Synthese von
5-Methylaminomethyl-2-thiouridin beteiligt sein könnte, die Polyribonukleotid
Nukleotidyltransferase (PNPase), das Transkriptions-Antiterminationsprotein NusB, das
ribosomale Proteine S2 und die Glutamin-Synthetase. Die Auswertung der
Gelchromatogramme der Größenausschlusschromatographie ergab, dass das
Elutionsvolumen der Fraktionen mit der maximalen RNase P-Aktivität einer Masse von 300 -
400 kDa entspricht. Demnach ist denkbar, dass die RNase P in A. aeolicus als Bestandteil
eines größeren Komplexes vorliegt. Hier könnten mehrere Enzyme des RNA-Metabolismus
funktionell miteinander gekoppelt sein. Eine gleichzeitige Anreicherung des ribosomalen
Proteins S2 und der 16S rRNA mit RNase P-aktiven Fraktionen könnte auch auf eine
Assoziation der RNase P mit der kleinen ribosomalen Untereinheit hindeuten.
Desweiteren konnten im Rahmen dieser Arbeit die Transkripte sowohl bekannter als auch
neu identifizierter nicht-kodierender RNAs aus A. aeolicus mittels Northern Blot-Analyse
nachgewiesen werden. Auch die bei Transkriptomanalysen von A. aeolicus gefundene starke
Transkription von antisense RNAs auf dem Gegenstrang nicht-kodierender RNA-Gene
konnte experimentell mittels Northern Blot verifiziert werden ((Lechner, Nickel, Wehner et al.,
im Druck), siehe Anhang 7.4). |
|---|---|
| Umfang: | 168 Seiten |
| DOI: | 10.17192/z2014.0250 |