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Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen zur Biosynthese von Mutterkornalkaloiden in Ascomyceten
Mutterkornalkaloide sind basische Naturstoffe, die zu der Gruppe der Indolalkaloide gehören. Sie zeigen ein breites Spektrum an pharmakologischen und zuweilen auch toxischen Wirkungen aufgrund ihrer strukturellen Ähnlichkeit zu den Neurotransmittern Dopamin, Serotonin und Adrenalin. Die Hauptproduze...
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| 1. Verfasser: | |
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| Beteiligte: | |
| Format: | Dissertation |
| Sprache: | Deutsch |
| Veröffentlicht: |
Philipps-Universität Marburg
2017
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| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | PDF-Volltext |
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| Zusammenfassung: | Mutterkornalkaloide sind basische Naturstoffe, die zu der Gruppe der Indolalkaloide gehören. Sie zeigen ein breites Spektrum an pharmakologischen und zuweilen auch toxischen Wirkungen aufgrund ihrer strukturellen Ähnlichkeit zu den Neurotransmittern Dopamin, Serotonin und Adrenalin. Die Hauptproduzenten sind filamentöse Pilze aus den Familien Clavicipitaceae und Aspergillaceae wie z.B. Claviceps purpurea, Aspergillus fumigatus oder Penicillium commune. Die ersten Schritte der Biosynthese von Mutterkornalkaloiden, ausgehend von L-Tryptophan, verlaufen bis zur Stufe von Chanoclavin-I Aldehyd in allen bekannten Produzenten gleich. Später verzweigen sich die Biosynthesewege und es entstehen unterschiedliche Endprodukte.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte der letzte, noch nicht aufgeklärte, gemeinsame Schritt der Biosynthese untersucht werden: die Umwandlung von 4-DMA-L-Abrin zu Chanoclavin-I. Diese Reaktion untergliedert sich in mindestens zwei Oxidations- und einen Decarboxylierungsschritt. Deletions-Experimente haben gezeigt, dass die FAD-abhängige Oxidoreduktase FgaOx1 und die Katalase FgaCat für die Bildung von Chanoclavin-I essenziell sind. Um den Reaktionsmechanismus aufzuklären, sollten beide Enzyme in E. coli oder S. cerevisiae überproduziert und biochemisch charakterisiert werden. Im Falle von fgaCat war die heterologe Expression in E. coli erfolgreich, es konnte jedoch für dieses Enzym alleine keine katalytische Aktivität festgestellt werden. Die Sequenz von FgaOx1 aus der NCBI-Datenbank wurde durch eine Analyse der Intron-Exon-Struktur korrigiert, eine Überproduktion des Proteins in E. coli oder S. cerevisiae konnte jedoch nicht erreicht werden.
Durch einen bioinformatischen Vergleich der Mutterkornalkaloid-Gene aus Aspergillus fumigatus, Claviceps purpurea und Arthroderma benhamiae mit den verfügbaren Genomsequenzen der Ascomyceten aus der NCBI-Datenbank konnten 15 weitere Spezies identifiziert werden, die die genetische Ausstattung für die Produktion von Mutterkornalkaloiden besitzen. Dazu zählen auch die beiden Pilze Penicillium roqueforti und Penicillium camemberti, die aufgrund ihrer industriellen Verwendung in der Käseherstellung bekannt sind. Im Rahmen der bioinformatischen Analysen wurden neben der Sequenz von FgaOx1 aus Aspergillus fumigatus auch die Proteinsequenzen von 27 weiteren Proteinen aus der NCBI-Datenbank durch Analyse der Intron-Exon-Struktur korrigiert. Durch die Identifizierung der Gencluster und die Korrektur der Sequenzen leistet diese Arbeit einen wertvollen Beitrag für die zukünftige Aufklärung der Biosynthesewege und die Analyse der strukturellen Vielfalt der Mutterkornalkaloide in den verschiedenen Produzenten.
In der Vergangenheit wurde bereits über die Produktion von Isofumigaclavin A in Penicillium roqueforti berichtet, allerdings gab es zu Beginn dieser Arbeit keine Publikationen, die Aufschluss über die Biosynthese dieser Substanz geben. Durch die Identifizierung von zwei Mutternkornalkaloid-Genclustern und zwei weiteren, nicht geclusterten Genen in unterschiedlichen Bereichen des Genoms wurde der Grundstein für die Aufklärung des Biosyntheseweges gelegt. In dieser Arbeit wurden acht Gene, die möglicherweise für die späteren Schritte der Biosynthese von Isofumigaclavin A verantwortlich sind, ausgewählt und für die heterologe Expression in E. coli und S. cerevisiae kloniert. Drei der Gene konnten erfolgreich in E. coli exprimiert werden und die entsprechenden Proteine (FgaDHPr, FgaOx3Pr3 und FgaATPr) wurden mittels Affinitätschromatographie aufgereinigt. Für FgaATPr konnte in den durchgeführten in vitro-Assays keine enzymatische Aktivität nachgewiesen werden. FgaDHPr wurde als kurzkettige Dehydrogenase/Reduktase charakterisiert, welche die Umwandlung von Chanoclavin-I zu Chanoclavin-I Aldehyd in Anwesenheit von NAD+ katalysieren kann. In der aktiven Form liegt das Enzym vermutlich als Pentamer vor. Der KM-Wert für Chanoclavin-I lag bei 573 μM und für NAD+ bei 82 μM. Die mittlere maximale Reaktionsgeschwindigkeit vmax betrug 326 nmol mg-1 min-1 und die Wechselzahl kcat 0,15 s-1. FgaOx3Pr3 gehört zur Gruppe der „Old Yellow Enzymes“ und fungiert als FMN-enthaltende und NAD(P)H-abhängige Oxidoreduktase. Im Rahmen der durchgeführten Enzym-Assays wurde FgaOx3Pr3 als Chanoclavin-I Aldehyd-Reduktase charakterisiert, die zusammen mit FgaFS aus Aspergillus fumigatus oder EasG aus Claviceps purpurea die Bildung von Festuclavin katalysieren kann. Des Weiteren wird in Anwesenheit von FgaOx3Pr3 die Aktivität der untersuchten Chanoclavin-I Dehydrogenasen (FgaDH, ChaDH, FgaDHPr und FgaDHPca) signifikant gesteigert. Es konnte mit Hilfe der durchgeführten Experimente nachgewiesen werden, dass die Aktivitätssteigerung auf eine Aufhebung der Produkthemmung der FgaDH-Reaktion durch FgaOx3Pr3 zurückzuführen ist. Da diese Fähigkeit noch für kein anderes Enzym dieser Klasse beschrieben wurde, handelt es sich bei FgaOx3Pr3 um ein einzigartiges, bifunktionales Enzym, das ein exzellenter Kandidat für die chemoenzymatische Synthese von Mutterkornalkaloiden des Clavin-Typs ist.
Über die Produktion von Mutterkornalkaloiden in Penicillium camemberti wurde bisher nicht in der Literatur berichtet. Auch in dieser Arbeit konnten in den Kulturextrakten der untersuchten Stämme keine Mutterkornalkaloide nachgewiesen werden, obwohl ein potenzielles Gencluster für deren Biosynthese identifiziert wurde. Die beiden Gene fgaDHPca und easHPca wurden für die heterologe Expression in E. coli und S. cerevisiae kloniert und konnten in beiden Organismen erfolgreich überproduziert werden. Für EasHPca konnte keine enzymatische Aktivität nachgewiesen werden. FgaDHPca wurde jedoch wie FgaDHPr ebenfalls als Chanoclavin-I Dehydrogenase charakterisiert, welche in ihrer aktiven Form als Tetramer vorliegt. Die ermittelten KM-Werte lagen bei 536 μM für Chanoclavin-I und 528 μM für NAD+. Die mittlere maximale Reaktionsgeschwindigkeit vmax betrug 383 nmol mg-1 min-1 und die Wechselzahl kcat 0,18 s-1. In dieser Arbeit wurde somit erstmals bewiesen, dass P. camemberti die genetische Ausstattung für die Biosynthese von Mutterkornalkaloiden besitzt. |
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| Umfang: | 208 Seiten |
| DOI: | 10.17192/z2017.0779 |