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Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen zur Biosynthese von Mykotoxinen aus Ascomyceten
Die Sekundärmetabolit-Produktion der Pilze stellt eine wichtige Quelle von biologisch aktiven Stoffen dar. Innerhalb der Sekundärmetabolite besitzen die Ergotalkaloide sowohl pharmazeutisch-nützliche als auch toxische Eigenschaften. Die Ergotalkaloide gehören zu den Indolalkaloiden. Momentan ist Cla...
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| 1. Verfasser: | |
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| Beteiligte: | |
| Format: | Dissertation |
| Sprache: | Deutsch |
| Veröffentlicht: |
Philipps-Universität Marburg
2012
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| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | PDF-Volltext |
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| Zusammenfassung: | Die Sekundärmetabolit-Produktion der Pilze stellt eine wichtige Quelle von biologisch aktiven Stoffen dar. Innerhalb der Sekundärmetabolite besitzen die Ergotalkaloide sowohl pharmazeutisch-nützliche als auch toxische Eigenschaften. Die Ergotalkaloide gehören zu den Indolalkaloiden. Momentan ist Claviceps purpurea (C. purpurea) einer der wichtigsten Stämme für die industrielle Ergotalkaloidproduktion. C. purpurea produziert hauptsächlich die Ergotalkaloide Ergotamin, Ergocryptin und verwandte Ergopeptine. Im Gegensatz dazu wurden aus Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) und Penicillium commune (P. commune) die Clavinalkaloide, darunter Festuclavin, Pyroclavin und die Fumigaclavine A, B und C, isoliert. Ein gemeinsames strukturelles Merkmal dieser Substanzen ist das tetrazyklische Ergolinringsystem.
Im Verlauf der Ergotalkaloidbiosynthese stellt Chanoclavin-I-Aldehyd einen Verzweigungspunkt dar. In C. purpurea wird Ergotamin und in A. fumigatus bzw. P. commune Fumigaclavin C bzw. A gebildet. Das Ergotamin enthält einen Tripeptidrest, während die Fumigaclavine andere Substituenten enthalten, z.B. eine Acetoxy-Gruppe an C-9. Zusätzlich unterscheiden sich Fumigaclavin C aus A. fumigatus bzw. Fumigaclavin A aus P. commune stereochemisch an der Position C-8 des Ergolinrings.
In dieser Arbeit wurde das Vorkommen von Ergotalkaloidgenclustern innerhalb der Ascomyceten untersucht. Dabei wurden aus 53 verschiedenen Pilzfamilien 138 in der NCBI-Datenbank verfügbare Pilzgenome auf Sequenzhomologien zu den sieben orthologen Genen von A. fumigatus und C. purpurea analysiert. Es wurden insgesamt 23 Pilze identifiziert, die putative Ergotalkaloidgencluster enthielten. Diese 23 Pilze verteilen sich innerhalb der Ascomyceten auf die drei Familien Clavicipitaceae, Trichocomaceae und Arthrodermataceae.
Zum funktionellen Nachweis wurde das Gen fgaOx1 aus A. fumigatus und sein Homolog easE aus C. purpurea untersucht. Beide Gene wurden in Expressionsvektoren kloniert und Expressionsbedingungen in Escherichia coli (E. coli) bzw. in Saccharomyces cerevisiae getestet. Leider blieben die Expressionsversuche der beiden Gene erfolglos. Weitere Proteinsequenzanalysen von FgaOx1 ergaben, dass wahrscheinlich zwei Membrandomänen vorhanden sind. Im Falle des Gens easE ergaben sich während der Untersuchungen der Pilzgenome der Ascomyceten neue Ergebnisse. Wahrscheinlich ist die Intron-Exon-Struktur innerhalb der NCBI-Datenbank fehlerhaft.
Die Verzweigungspunkte der Ergotalkaloidbiosynthesen in C. purpurea, A. fumigatus und P. commune wurde durch diese Arbeit weiter aufgeklärt. Durch die Expression der Gene easA und easG aus C. purpurea und deren Aufreinigung sowie der biochemischen Charakterisierung der kodierten Proteine konnte gezeigt werden, dass Chanoclavin-I-Aldehyd in Gegenwart von reduziertem Glutathion durch EasG allein zu Agroclavin umgesetzt wird. Für diesen Schritt war keine Beteiligung von EasA nötig, vielmehr scheint das Protein EasA seine Funktion evolutionär verloren zu haben. In dem postulierten Reaktionsmechanismus von Chanoclavin-I-Aldehyd zu Agroclavin werden ein Isomerisierungs- und ein Reduktionsschritt benötigt. Es konnte gezeigt werden, dass die Isomerisierung durch ein nicht-enzymatisches Intermediat von Chanoclavin-I-Aldehyd mit Glutathion (GSH) vollzogen wird. Die Reduktion hingegen erfolgt enzymatisch durch das Protein EasG, das als Iminreduktase fungiert. Für die Katalyse benötigt EasG den Kofaktor NADPH. Die Struktur des Agroclavins wurde eindeutig durch NMR- und MS-Analysen identifiziert.
Durch die Kombination von FgaOx3 aus A. fumigatus mit EasG aus C. purpurea konnte gezeigt werden, dass beide Proteine zusammen die Reaktion von Chanoclavin-I-Aldehyd zu Festuclavin und seinem Stereoisomer Pyroclavin katalysieren. Zuvor war nur bekannt, dass FgaOx3 und FgaFS aus A. fumigatus zusammen Festuclavin bilden. Im Zusammenhang mit diesen Ergebnissen erfolgte die Amplifikation und anschließende Expression der orthologen Gene fgaOx3pc und fgaFSpc aus P. commune NRRL2033 und die Aufreinigung beider Proteine. Die Kombination aller Orthologen lieferte neue Erkenntnisse über den Reaktionsmechanismus und damit auch über den Verzweigungspunkt der Ergotalkaloidbiosynthese in A. fumigatus und P. commune. Im Unterschied zum Reaktionsmechanismus in C. purpurea werden in A. fumigatus und P. commune zwei Reduktionsschritte für die Umsetzung von Chanoclavin-I-Aldehyd zu Festuclavin und Pyroclavin benötigt. Dabei katalysieren FgaOx3 bzw. FgaOx3pc den ersten und die Iminreduktasen FgaFS bzw. FgaFSpc den zweiten Reduktionsschritt. Im Gegensatz zu früher veröffentlichten Hypothesen einer anderen Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass die Iminreduktasen FgaFS bzw. FgaFSpc die Stereochemie der Gesamtreaktion festlegen und nicht die auch als old yellow enzymes bekannten Reduktasen FgaOx3 bzw. FgaOx3pc. Zudem wird durch die jeweilige Iminreduktase das Produktverhältnis zwischen Festuclavin und Pyroclavin festgelegt. |
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| DOI: | 10.17192/z2012.0508 |