Regulation of secretion of the signalling protease PopC in Myxococcus xanthus

Unter Nährstoffmangel initiiert Myxococcus xanthus ein Differenzierungsprogramm, das die Bildung von multizellulären Fruchtkörpern ermöglicht. Der Ablauf dieses Programms ist abhängig von interzellulären Kommunikationsprozessen und involviert mindestens zwei interzelluläre Signale, das A-Signal und das C-Signal. Das Zellkontakt-abhängige C-Signal induziert und koordiniert die für die Fruchtkörperbildung essentiellen morphogenetischen Prozesse der Aggregation und Sporulation, sowohl räumlich als auch zeitlich. Dieses Signal ist ein 17 kDa Protein (p17), das aus der proteolytischen Spaltung des 25 kDa CsgA-Proteins (p25) hervorgeht, und ist essentiell für die Fruchtkörperbildung. p25 und PopC, die Protease die p25 spaltet, akkumulieren unter vegetativen Bedingungen in der äußeren Membran bzw. im Zytoplasma. Unter Nährstoffmangelbedingungen kommt es dann zu einer spezifischen Sekretion von PopC. Dieser Mechanismus der Kompartimentalisierung garantiert, dass eine Spaltung von p25 nur in hungernden Zellen erfolgen kann. Der Hauptschwerpunkt dieser Arbeit betrifft die Mechanismen, die der regulierten Sekretion der Protease PopC zugrunde liegen. Zunächst galt es die Proteine zu identifizieren, die für die PopC Sekretion benötigt werden. PopC verfügt über kein Signalpeptid und wird in einer nicht-prozessierten Form sekretiert. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass weder zwei unvollständige Typ-III-, noch ein Typ-IV noch ein Typ-I Sekretionssystem an der Sekretion von PopC beteiligt sind.Aus einer Sammlung von Mutanten, die durch zufällige Transposon-Insertionen entstanden sind und keine Fruchtkörper mehr bilden können, wurden sieben Mutanten identifiziert, in denen keine PopC Sekretion mehr stattfand. Keine der dazugehörigen Insertionen waren in Genen lokalisiert, die für bekannte Sekretionssysteme kodieren. Basierend auf den entsprechenden Insertionspositionen wurden drei Klassen definiert:Die Mutation der ersten Klasse war in einem Gencluster lokalisiert, dass überwiegend Proteine unbekannter Funktion kodiert. Diese Proteine lokalisieren vermutlich in der Zellhülle und zeigen, mit der Ausnahme von einer D,D-Carboxypeptidase und zwei Ser/Thr Kinasen, eine eingeschränkte phylogenetische Verbreitung. Die zweite Klasse von Mutationen fand sich in zwei Genclustern, die paraloge Proteine mit unbekannter Funktion kodieren. Bei diesen Proteinen handelt es sich vermutlich um zytoplasmatische Proteine. Viele Gene dieser 2. Klasse sind phylogenetisch weit verbreitet und finden sich oftmals in Genclustern, die sich in Nachbarschaft mit Sekretionssystem-kodierenden Genen befinden. Wir nehmen an, dass die Klasse 1 Mutation ein neuartiges Sekretionssystem beeinflusst, dass an der PopC Sekretion beteiligt ist. Wir vermuten außerdem, dass die Klasse 2 Mutationen Proteine beeinflussen, die akzessorische oder regulatorische Funktionen bei der PopC Sekretion einnehmen. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf dem Mechanismus, mit dem die PopC Sekretion unter Nährstoffmangelbedingungen aktiviert wird. Die vorliegenden Daten demonstrieren, dass die PopC Sekretion auf post-translationaler Ebene durch eine regulatorische Kaskade kontrolliert wird, an der die Proteine RelA und PopD beteiligt sind. Dabei wird RelA für die Aktivierung der PopC Sekretion unter Nährstoffmangelbedingungen benötigt, und PopD, dessen Gen zusammen mit popC in einem Operon exprimiert wird, interagiert direkt mit PopC und fungiert dabei als Inhibitor der PopC Sekretion. Auf der Basis genetischer und biochemischer Daten vermuten wir, dass in der Anwesenheit von Nährstoffen PopC und PopD einen zytoplasmatischen Komplex bilden, der eine PopC Sekretion unterbindet. Unter Nährstoffmangel kommt es zu einer RelA-abhängigen Induktion der stringenten Antwort. Durch diese stringente Antwort wird durch einen noch nicht geklärten Mechanismus die proteolytische Degradation von PopD innerhalb des PopC/PopD Komplexes initiiert, wodurch PopC für eine anschließende Sekretion freigesetzt wird. Auf der Basis dieser Daten scheint die Bildung von p17 von einer zweischrittigen proteolytischen Kaskade abzuhängen; zunächst erfolgt eine Degradation von PopD und später die spezifische Spaltung von p25 durch PopC. Das gegenwärtige Modell des interzellulären A-Signals in M. xanthus basiert auf der Annahme, dass unter Nährstoffmangel extrazelluläre A-Signal Proteasen freigesetzt werden. Diese Proteasen sollen dann sowohl Oberflächenproteine als auch extrazelluläre Proteine spalten und dadurch die A-Signal Aminosäuren und Peptide freisetzen, die den Zellen als Sensor der Populationsdichte dienen. DNA-Mikrochip-Analysen (S. Wegener-Feldbrügge, nicht veröffentlicht) ließen vermuten, dass der primäre Defekt von asgA- und asgB-Mutanten, die kein A-Signal bilden können, nicht in einer reduzierten Protein Sekretion begründet ist, sondern auf eine reduzierte Expression von Genen, die Proteasen u. a. auch PopD kodieren. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass nur durch die wiederhergestellte Expression von popCD die Differenzierungsdefekte von asgA- und asgB-Mutanten aufgehoben werden können, und zwar ohne gleichzeitige Bildung des A-Signals. Die ektopische Expression von popCD umgeht somit während der Differenzierungsphase die A-Signal Abhängigkeit. Wir vermuten, dass die Differenzierungsdefekte der asgA- und asgB-Mutanten daher zwei Gründe haben: (i) eine reduzierte Expression von Genen, die A-Signal Proteasen kodieren, und (ii) eine reduzierte Expression des popC Gens.