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Wechselwirkungen von SARS-Coronavirus mit zellulären Abwehrmechanismen
Das im Jahre 2003 erstmals isolierte SARS-Coronavirus (SARS-CoV) verursacht bei Menschen ein schweres akutes Atemwegssyndrom mit einer Mortalitätsrate von 10%. Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, ob SARS-CoV in zelluläre Abwehrmechanismen eingreift, was zu der für CoV einzigartigen Humanpat...
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| Hovedforfatter: | |
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| Andre forfattere: | |
| Format: | Dissertation |
| Sprog: | tysk |
| Udgivet: |
Philipps-Universität Marburg
2008
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| Fag: | |
| Online adgang: | PDF-Volltext |
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| Summary: | Das im Jahre 2003 erstmals isolierte SARS-Coronavirus (SARS-CoV) verursacht bei
Menschen ein schweres akutes Atemwegssyndrom mit einer Mortalitätsrate von
10%. Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, ob SARS-CoV in zelluläre
Abwehrmechanismen eingreift, was zu der für CoV einzigartigen Humanpathogenität
beitragen könnte. Zu diesen Abwehrmechanismen zählen die Typ-I-Interferon (IFN)-
Antwort sowie die Induktion von Apoptose. Die IFN-Antwort wird in SARS-CoVinfizierten Zellen nicht induziert, obwohl doppelsträngige (ds) RNA, bekannt als IFNInduktor, anwesend ist. Daher wurde vermutet, dass Proteine des SARS-CoV die Induktion von IFNs inhibieren.
Zunächst wurden die Proteinprodukte aller offener Leserahmen (ORFs) des SARSCoV
auf ihre Fähigkeit überprüft, die IFN-Antwort zu hemmen. In einem IFNsensitiven
Reportergen-Assay konnte jedoch keines der Proteine als IFN-Antagonist
identifiziert werden. Die Expression der viralen Proteine ORF 7a und ORF 7b führte sogar zur Induktion der IFN-Antwort sowie zur Induktion von Apoptose. Eine natürlich entstandene Deletionsmutante von ORF 7b induzierte dagegen weder die IFNAntwort noch Apoptose. Die Inhibition von ORF 7a und 7b führte im Falle eines ORF 7a-spezifischen Inhibitors zur Reduktion freigesetzter SARS-CoV-Partikel, was vermutlich auf eine unspezifische Bindung des Inhibitors an regulatorische Sequenzen im 5’-nicht translatierten Bereich des SARS-CoV-Genoms zurückzuführen ist.
Weiterhin konnte gezeigt werden, dass SARS-CoV in der späten Phase der Infektion
Apoptose induziert. Nachgewiesen wurde die Spaltung der Caspasen 3 und 8 sowie
die der poly-ADP-ribose-polymerase-1 (PARP). Die Infektion hatte jedoch keinen
Einfluss auf die relativen Proteinmengen von Bcl2 und Bax.
Ein wichtiges Bindeglied zwischen IFN-Antwort und Apoptose ist die antivirale
Protein Kinase PKR. Sie wird durch Typ-I-IFNs induziert und phosphoryliert die a-Untereinheit des eukaryotischen Translationsinitiationsfaktor-2 (eIF2a), was zum Stopp der Translation in Zellen führen kann. Über diesen Weg, wie auch über direkte Interaktionen mit pro-apoptotischen Proteinen, ist PKR an der Induktion von Apoptose beteiligt. Weitere Kinasen, die eIF2a als Antwort auf virale Infektionen phosphorylieren, sind PERK und GCN2.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde festgestellt, dass die PKR in SARS-CoV-infizierten
Zellen durch dsRNA aktiviert wird. Um die Konsequenzen dieser Aktivierung zu
untersuchen, wurde die PKR-Expression in SARS-CoV-infizierten Zellen durchsynthetische DNA-Analoga, Peptid-gekoppelte Phosphorodiamidat-Morpholino-
Oligomere (PPMO), die sich an die Ziel-mRNA anlagern, gehemmt. Der effizienteste
Inhibitor exon-8 (ex-8) konnte die PKR-Expression um 98% reduzieren. Durch die
Bindung von ex-8 an die PKR-mRNA werden Spleißstellen maskiert, was zum
Entfernen von Exons aus der mRNA und damit zur Synthese trunkierter Proteine
führt.
Es konnte eindeutig gezeigt werden, dass die Inhibition der PKR durch PPMO ex-8
zu einer verminderten Induktion von Apoptose durch SARS-CoV führte. Die
Phosphorylierung von eIF2a hingegen war in diesen Zellen nicht reduziert. Das lässt vermuten, dass SARS-CoV die PKR-vermittelte Apoptose nicht über eIF2a induziert.
Überraschenderweise hatte die Inhibition der PKR und die daraus resultierende
Reduktion der Apoptose keinen Einfluss auf die Vermehrung von SARS-CoV. Wurde
die Inhibition von Apoptose in SARS-CoV-infizierten Zellen durch die Behandlung mit einem Caspase-Inhibitor gehemmt, so beeinflusste das die Virusreplikation ebenfalls nicht. Das heißt die Induktion von Apoptose ist für die effiziente Vermehrung des SARS-CoV nicht von Bedeutung.
Weitergehende Analysen anderer eIF2a-phosphorylierender Kinasen ergaben, dass
PERK, nicht jedoch GCN2 durch eine Infektion mit SARS-CoV induziert wurde. Die
Vorbehandlung SARS-CoV-infizierter Zellen mit IFN b führte zur reduzierten
Phosphorylierung von eIF2a und PERK, auch die Menge freigesetzter SARS-CoV
war deutlich reduziert. Da die Phosphorylierungsmuster von eIF2a und PERK in
SARS-CoV-infizierten Zellen übereinstimmten, und die Inhibition der PKR keinen
Einfluss auf die Phosphorylierung von eIF2a hatte, wird vermutet, dass die
Phosphorylierung von eIF2a in SARS-CoV-infizierten Zellen hauptsächlich durch
PERK vermittelt wird. Die Phosphorylierung von eIF2a hatte keinen Einfluss auf die Vermehrung von SARS-CoV. Das Virus hat daher vermutlich Strategien entwickelt die inhibitorischen Effekte von eIF2a zu umgehen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Induktion der PKR sowie der Apoptose
durch SARS-CoV keinen Einfluss auf die Vermehrung des Virus hat. Ob die
Aktivierung von PERK und die Phosphorylierung von eIF2a von Vorteil für SARSCoV
sind, könnte Gegenstand weiterer Untersuchungen sein. |
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| Fysisk beskrivelse: | 159 Seiten |
| DOI: | 10.17192/z2008.0494 |