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Strukturelle und funktionelle Charakterisierung neuartiger Transkriptionsmodulatoren
Für die Wirkstoffforschung ist eine vollständig aufgeklärte Wirkweise eines Targets inklusive bekanntem Bindungsmodus essentiell, damit dessen Modulatoren unter anderem besser hinsichtlich ihrer Potenz, der Selektivität und der Pharmakodynamik optimiert werden können. Deshalb ist für die Mechanismus...
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| 1. Verfasser: | |
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| Beteiligte: | |
| Format: | Dissertation |
| Sprache: | Deutsch |
| Veröffentlicht: |
Philipps-Universität Marburg
2019
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| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | PDF-Volltext |
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| Zusammenfassung: | Für die Wirkstoffforschung ist eine vollständig aufgeklärte Wirkweise eines Targets inklusive bekanntem Bindungsmodus essentiell, damit dessen Modulatoren unter anderem besser hinsichtlich ihrer Potenz, der Selektivität und der Pharmakodynamik optimiert werden können. Deshalb ist für die Mechanismusaufklärung die Entwicklung selektiver und potenter Substanzen wichtig, wodurch die beteiligten Komponenten identifiziert und die Interaktionen dieser Proteine und Cofaktoren untersucht werden können.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde zum einen die Target-Identifizierung und Mechanismusaufklärung bei zwei verschiedenen Transkriptionsregulations-Prozessen untersucht. Für die Entwicklung neuer potenter Modulatoren des Hedgehog-Signalweges wurde die Struktur-Wirkungsbeziehung in einem zell-basierten Assay untersucht, um die identifizierte Strukturklasse durch Modifizierungen der Substituenten bezüglich ihrer Potenz zu verbessern. Anhand dieser strukturellen Erkenntnisse konnte eine biotinylierte Substanz entwickelt werden, mit der in einem pull-down Experiment das unbekannte Target isoliert und anschließend über massenspektrometrische Analyse identifiziert werden könnte. Zum anderen wurde die zuvor beobachtete Differenzierungsförderung bei myeloiden Knochenmarkzellen zu dendritischen Zellen durch Vertreter der Stilben-Strukturklasse (DG172) näher untersucht, die einem anderen Genexpressions-regulationsmechanismus zugrunde liegen. Bei vorherigen Untersuchungen dieser Substanzklasse auf die Differenzierung wurde ein PPARβ/δ-unabhäniger Effekt beobachtet, dessen Entstehung und Target vollkommen unbekannt sind. Daher wurde ein entwickeltes biotinyliertes PPARβ/δ-inaktives Derivat hinsichtlich der Potenz auf die Differenzierungsverschiebung zur Bildung der Dendriten geprüft, um anschließend das Targetprotein oder den Komplex isolieren und identifizieren zu können. Die Analyse erfolgte über die Oberflächenmarkierung mittels anti-MHC II und anti-CD11c sowie anti-Ly-6B und anti-Ly-6G Antikörpern zur Bestimmung des Anteils an dendritischen Zellen beziehungsweise neutrophilen Granulozyten über FACS-Analyse. Die biotinylierte Verbindung LD253 war sehr schwach aktiv und die Zelldifferenzierung daher sehr wahrscheinlich noch nicht vollständig abgeschlossen. Deshalb bedarf das Experiment weiterer Optimierung, um einen klaren Effekt der Verschiebung der Zelldifferenzierung beobachten und daraufhin das Target erfolgreich identifizieren zu können.
Neben der Target-Identifizierung und der Begleitung des Liganden-basierten Wirkstoffdesigns wurde der Bindungsmodus zwischen Transkriptionsmodulatoren und dem Target PPARβ/δ untersucht. Zur Zeit existiert keine Proteinstruktur in Komplex mit inversen Agonisten, weshalb die Bedingungen für eine optimale Generierung von Proteinkristallen untersucht wurden. Das Herstellungsprotokoll für die PPARβ/δ-LBD konnte erfolgreich auf eine Ausbeute von 26,7 mg L 1eingesetztem Medium beziehungsweise 1.482,0 µg g 1 Zellen nach der Affinitätschromatographie optimiert werden, sodass nun eine ausreichende Proteinmenge für ein Kristallisationsscreening zur Verfügung gestellt werden konnte. Dies entspricht einer fünffachen Verbesserung zu den bisherigen publizierten Protokollen beziehungsweise einer 110fachen Steigerung der Ausbeute im Vergleich zu Gruppe um Sinz. Bei der Kristallisation wurden zwei Ansätze verfolgt, einerseits die Co-Kristallisation mit dem für die Stabilisierung essentiellen CoRepressor und andererseits die direkte Zugabe des CoRepressors beim Screen. In beiden Ansätzen wurde bisher noch kein Proteinkristall der PPARβ/δ-LBD im Komplex mit den potenten inversen β/δ-Agonisten ST247, PT-S264 oder DG172 erhalten, aber die Platten werden weiterhin inkubiert und beobachtet.
Zusammenfassend wurden durch funktionelle Studien sowie Untersuchungen der Struktur-Wirkungsbeziehung die Strategien zur Target-Identifizierung geprüft und validiert, um anschließend das Zielprotein und die Cofaktoren bestimmen zu können. Basierend auf diesen Studien wurden Substanzen entwickelt, mit denen das Target isoliert werden könnte. Weiterhin wurde versucht den Bindungsmodus zwischen dem Liganden-induzierten Transkriptionsfaktor PPARβ/δ-LBD und selektiven inversen Agonisten verschiedener Strukturklassen über Proteinkristallographie visualisieren zu können, um in einem Struktur-basierten Ligandendesign den Wirkstoff-Kandidaten weiter optimieren zu können. Dafür konnte ein stabiler Herstellungsprozess für die PPARβ/δ-LBD etabliert und bezüglich der Ausbeute optimiert werden, sodass nun in großen Mengen sehr sauberes Protein isoliert werden konnte. Diese gewonnenen Ergebnisse bieten einen tieferen Einblick in den vielschichtigen Prozess der Transkriptionsregulation, mit dem Ziel durch Einsatz potenter Modulatoren dieses gezielt zu regulieren und somit als Angriffspunkt und damit einen weiteren Bereich in der Wirkstoffforschung zu eröffnen. |
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| Umfang: | 126 Seiten |
| DOI: | 10.17192/z2019.0115 |