Genome Mining-based Studies on the Biosynthesis of Terpenoids and Alkyl Salicylaldehyde Derivatives in Aspergillus ustus

Naturstoffe, definiert als solche, die dem Sekundärstoffwechsel entstammen, werden von Bakterien, Pilzen und Pflanzen produziert. Sie sind nicht essentiell für Wachstum, Entwicklung und Fortpflanzung eines Organismus, verschaffen ihren Produzenten aber spezifische Vorteile. Infolgedessen weisen viele Sekundärmetaboliten biologische Aktivitäten auf und können als Arzneimittel oder Leitsubstanzen solcher für die Gesundheit von Menschen zum Nutzen sein. Pilze sind eine ergiebige Quelle für die Entdeckung von Naturstoffen. Mit Fortschritten bei Sequenzierungstechnologien und bioinformatischen Analysetools kann das große Potenzial, das in Genomen steckt, erschlossen werden. Gentechnische Methoden und Verbesserungen in den Analysetechnologien bieten die dafür notwendigen Werkzeuge. Die Entdeckung biosynthetischer Gene wird durch ihre Clusterarchitektur erleichtert. Anhand des Gens, das das jeweilige ‘Backbone-Enzym’ kodiert, kann eine Klassifizierung des produzierten Sekundärmetaboliten vorgenommen werden, z.B. Polyketide, nicht-ribosomale Peptide und Terpenoide. Durch die Genomanalyse von Aspergillus ustus 3.3904 wurden mehrere uncharakterisierte biosynthetische Gencluster (BGCs) mit Genen aufgedeckt, die für verschiedene ‘Backbone Enzyme’ und mehrere modifizierende Enzyme kodieren. Darunter sind zwei mutmaßliche Terpenzyklasen und ein vermutlich zwölf Gene umfassendes BGC, welche Gegenstand dieser Arbeit sind. Im ersten Projekt wurde eine Sesquiterpenzyklase, GdlS, identifiziert und als Germacradienolsynthase durch heterologe Expression und biochemische Charakterisierung einschließlich Tests zur Substratspezifität, Ionenabhängigkeit und Bestimmung kinetischer Parameter bestätigt. Germacradienol ist das wichtigste Zwischenprodukt in der Geosmin-Biosynthese. Der Mechanismus einer bifunktionellen Germacradienol/Geosmin Synthase wurde in den letzten 25 Jahren ausführlich in Bakterien untersucht. Es wurden nur zwei Berichte über die Biosynthese von Germacradienol und Geosmin in Pilzen beschrieben. Die phylogenetische Analyse der N-Termini und der C-Termini der Germacradienol/Geosmin-Synthase SCO6073 aus Streptomyces coelicolor mit Homologen aus anderen Bakterien und Pilzen ergab eindeutig die Existenz unterschiedlicher Kladen für Bakterien, Ascomyceten und Basidiomyceten. Genauer, die Existenz mutmaßlicher bifunktioneller Enzyme in Bakterien, die sowohl die Umwandlung von FPP in Germacradienol als auch dessen Fragmentierung zu Geosmin katalysieren, sowie die Existenz von Homologen für Pilze, die sehr wahrscheinlich für zwei unterschiedliche Enzyme kodieren, die die beiden Reaktionen unabhängig voneinander katalysieren. Dies führte zu der Annahme einer anderen Strategie für die Germacradienol- und Geosminproduktion in Bakterien und Pilzen. Der Arbeitsablauf für das zweite Projekt war der gleiche wie für das erste Projekt. Heterologe Expression und in vitro Reaktion mit rekombinantem Protein bestätigen MfdS als Malfilanol D Synthase. Die Promiskuität des Enzyms wurde durch Verwendung verschiedener Substrate und Metallionen getestet. Die kinetischen Parameter wurden bestimmt. Malfilanol D ist ein Sesquiterpenoid der weniger untersuchten Bicyclo[5.4.0]undecan Klasse. Die Biosynthese anderer zu dieser Klasse gehörenden Substanzen, z. B. β-Himachalene, wird über einen C-1 zu C-11 Ringschluss nach der Isomerisierung von FPP zu NPP vorgeschlagen. Als Ergebnis dieses Zyklisierungsverfahrens wird die geminale Dimethylgruppe direkt an den 6/7 fusionierten Ring gebunden. Malfilanol D und seine Artgenossen, Malfilanol A – C, unterscheiden sich davon, dass die geminale Dimethylgruppe durch eine CH2-Gruppe vom fusionierten Ring getrennt ist. Daher wird von einer anderen Zyklisierungsstrategie ausgegangen. Um tiefe Einblicke in den Mechanismus von MfdS zu erhalten, wurde ein Fütterungsexperiment mit 13C-markierten Vorstufesubstanzen durchgeführt. Die anschließende Isolierung und Interpretation der 13C-NMR-Daten lieferte Hinweise auf eine C 1 zu C-10 Zyklisierung mit aufeinanderfolgenden Alkyl- und Hydridmigrationen und einem C-1 zu C-6 Ringschluss, um das Grundgerüst von Malfilanol A – D zu generieren. Diese Ergebnisse bestätigen einen neuartigen Zyklisierungsmechanismus für Sesquiterpenoide mit einem Bicyclo[5.4.0]undecan Gerüst. Diese Arbeit wurde in Zusammenarbeit mit Zheng-Xi Zhang durchgeführt. Im dritten Projekt wurde ein mutmaßliches psa BGC mit zwölf Genen identifiziert, das neben anderen modifizierenden Genen für eine hoch-reduzierende Polyketidsynthase (HR-PKS), mehrere kurzkettige Dehydrogenasen / Reduktasen (SDRs) und ein Cupin-Domänen enthaltendes Protein kodiert. Da die Bildung von Alkylsalizylaldehyden und deren Derivaten die Beteiligung einer HR-PKS, zweier SDRs und eines Cupin-Domänen enthaltenden Proteins erfordert, das als Aromatase fungiert, wurden ähnliche Clusterprodukte vormutet. Die heterologe Expression dieser Gene bestätigte diese Hypothese, aber mit einer großen Ausnahme. Genauer gesagt führte die heterologe Expression von nur der HR-PKS und zwei SRDs zur Akkumulation von vier Produkten, darunter drei aromatische Substanzen. Die Deletion einzelner Gene bewies die Notwendigkeit dieser drei Gene für die Bildung aromatischer Produkte. Die Einführung von psaCP (cupin-Domänen enthaltendes Protein) erhöht nicht die Produktion aromatischer Produkte durch eine durch Wassereliminierung katalysierte Aromatisierung, wie in einer sehr aktuellen Veröffentlichung berichtet wird. PsaCP lenkt den Biosyntheseweg auf die Hauptprodukte anstelle auf die Nebenprodukte und fungiert wahrscheinlich als Reduktase. Diese Hypothese wird weiterhin untersucht.