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Komparative Funktionsanalyse der GPI-spezifischen Metallophosphoesterasen Cdc1, Ted1 und Dcr2 aus Saccharomyces cerevisiae
Die Biosynthese von Glycosylphosphatidylinositol (GPI) und der Transport von GPI-verankerten Proteinen vom ER zur Plasmamembran oder der Zellwand wird in Eukaryoten durch ein komplexes Prozessierungs- und Sortierungsnetzwerk vermittelt, an dem mehr als 20 bekannte Enzyme beteiligt sind. In der Bä...
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| Autore principale: | |
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| Altri autori: | |
| Natura: | Dissertation |
| Lingua: | tedesco |
| Pubblicazione: |
Philipps-Universität Marburg
2023
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| Soggetti: | |
| Accesso online: | PDF Full Text |
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| Riassunto: | Die Biosynthese von Glycosylphosphatidylinositol (GPI) und der Transport von GPI-verankerten
Proteinen vom ER zur Plasmamembran oder der Zellwand wird in Eukaryoten durch ein komplexes
Prozessierungs- und Sortierungsnetzwerk vermittelt, an dem mehr als 20 bekannte Enzyme beteiligt
sind. In der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae katalysieren die Metallophosphoesterasen
(MPEs) Cdc1 zusammen mit Ted1 und Dcr2 zwei wesentliche Schritte der GPI-Anker Prozessie-
rung. In einem Schritt wird der Ethanolaminphosphat Rest der Mannose-2 (EtNP-2) des GPI-Kerns
durch Ted1 im ER entfernt. Dies ist eine Reaktion, die für den effizienten Export aus dem ER erfor-
derlich ist. Des Weiteren kann EtNP-2 auch durch Dcr2 im Golgi-Apparat entfernt werden. In ei-
nem weiteren Schritt entfernt das Golgi lokalisierte Cdc1 den EtNP Rest von Mannose-1 (EtNP-1)
des GPI-Kerns. Diese Reaktion ist mutmaßlich essentiell für die Sortierung von GPI-verankerten
Proteinen von der Plasmamembran zur Zellwand. Während die essentielle Funktion dieser drei En-
zyme bei der Proteinsortierung durch eine Vielzahl genetischer und zellbiologischer Experimente
aufgedeckt wurde, ist die spezifische Rolle der MPEs bei Zellwandstress oder Biofilmbildung noch
nicht im Detail untersucht. Zudem ist die strukturelle Grundlage für die spezifische Substraterken-
nung und -verarbeitung durch diese Enzyme weitgehend unbekannt.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurden die spezifischen Funktionen der Gene CDC1, TED1 und DCR2
bezüglich Zellwandstress und Biofilmbildung untersucht. Hierzu wurden Hefestämme mit verschie-
denen Gendosen dem Wachstum unter verschiedenen Substanzen, die mit der Zellwand inteferieren
oder unter der Biofilmbildung untersucht. Die durchgeführten Untersuchungen deuten darauf hin,
dass Cdc1 spezifisch sensitiv gegenüber den Zellwand einlagernden Substanten Kongorot und Cal-
cofluorweiß ist, während Ted1 und Dcr2 Sensitivität gegenüber des β1-3-Glucansynthase-Inhibitors
Caspofungin zeigten. Diese Befunde lassen sich durch unterschiedliche Substratspezifitäten der drei
Enzyme erklären. Im Gegensatz dazu wurde keine spezifische Funktion der drei MPEs während der
Biofilmbildung beobachtet.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine Struktur-basierte Analyse von Cdc1, Ted1 und Dcr2 durch-
geführt, um für die Enzymfunktion essentielle Reste zu identifizieren. Insgesamt wurden 30 bisher
unbekannte essentielle Reste identifiziert, die an der Bindung des Co-Faktors, der Substratbindung
oder der strukturellen Integrität der Enzyme beteiligt sein könnten. Zudem wurden insgesamt 15
weitere Reste gefunden, die für die volle Funktion der Proteine unter Zellwandstress erforderlich
sind.
III
Ziel des letzten Teils war es, eine Variante von Cdc1 mit einer Ted1-artigen Funktion zu erhalten,
um Reste zu identifizieren, die möglicherweise die Substratspezifität vermitteln. Mit Hilfe in vitro-
Evolution-basierten Ansatzes konnte eine Cdc1-Variante mit 33 mutierten Aminosäuren (Cdc1MORF)
isoliert werden, welche dazu in der Lage war, den Zn2+-abhängigen Wachstumsdefekt eines Hefes-
tammsohne Ted1 zu komplementieren, nicht aber den letalen Wachstumsphänotypen in gleichzeiti-
ger Abwesenheit von Ted1 und Dcr2. Dieser Befund deutet darauf hin, dass Cdc1MORF keine verän-
derte Spezifität für die Bindung und Prozessierung von EtNP-2 aufweist, sondern stattdessen eine
bisher unbekannte Funktion erworben haben könnte, die eine erhöhte Zn2+-Resistenz vermittelt. Al-
lerdings konnte auch gezeigt werden, dass Cdc1MORF nicht mehr dazu in der Lage war, den letalen
Wachstumsphänotypen eines Stammes ohne Cdc1 zu komplementieren. Durch eine Feinanalyse der
33 Mutationen konnte dieser Phänotyp zur Identifizierung weiterer funktioneller Reste von Cdc1
führen.
Insgesamt konnten im Rahmen dieser Arbeit strukturelle Hotspots auf der Oberfläche von GPI-spe-
zifischen MPEs identifiziert werden, die an der Bindung von Co-Faktoren, Substraten oder der
strukturellen Integrität der Enzyme beteiligt. Auch konnten Reste ermittelt werden, welche die ro-
buste Funktion unter Zellwandstress gewährleisten. |
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| DOI: | 10.17192/z2024.0056 |