Multifunctional thermosensitive liposomes for antitumor therapy

In dieser Dissertation wurden thermosensible liposomale Wirkstofffreisetzungssysteme für die Antikrebstherapie entwickelt und an 3D-Zellkulturmodellen untersucht. Multizelluläre Tumorsphäroide (MCTS) wurden generiert, um solide Tumorumgebungen in vivo möglichst genau zu imitieren. Die Sphäroidkultivierung bietet viele Vorteile gegenüber herkömmlichen 2D-Zellkulturen, darunter eine 3D Zell-Architektur vergleichbar mit einem Tumor, natürlichere Zellmorphologie, Nährstoff- und Arzneimitteldiffusionsgradienten sowie Zell-Zell-Verbindungen und Zell-ECM-Interaktionen. Das Modell der TNBC-Zelllinie MDA-MB-231 wurde für die Generierung der Sphäroide in allen Experimenten verwendet. MDA-MB-231 Spheroide wurden in agarosebeschichteten Mehrwellplatten erzeugt und mit Kollagen I ergänzt. Das Sphäroid ist vom inneren zum äußeren Bereich in drei Zonen unterteilt: die Proliferationszone, die Ruhezone und die Nekrosezone. Das erste Projekt befasste sich mit der Erzeugung thermosensitiver Liposomen (TSL) und ihrer Beladung mit dem Chemotherapeutikum Doxorubicin (DOX), einem häufig verwendeten Chemotherapeutikum für verschiedene Krebsarten. Die Anwendung von reinem DOX führt zu schweren Nebenwirkungen wie Kardio- und Hepatotoxizität, die durch fortschrittliche, biokompatible Wirkstofffreisetzungssysteme reduziert werden können, welche DOX direkt an den Tumorort transportieren. Zu diesem Zweck wurden thermosensible Liposomen hergestellt, die DOX enthielten (DOX-TSL). Die leeren Liposomen wurden durch die konventionelle Dünnschicht-Hydratationsmethode hergestellt. Anschließend wurde DOX mittels „Remote-Loading“-Verfahren inkorporiert, welches einen Ammoniumsulfatgradienten zwischen dem Inneren und Äußeren des Liposoms zur Beladung verwendet. Die Ultrazentrifugenmethode wurde verwendet, um nicht verkapseltes DOX abzutrennen und die DOX-TSL Liposomen zu reinigen. Der hydrodynamische Durchmesser und das Zetapotential der Liposomen wurden mittels dynamischer Lichtstreuung (DLS) und Laser-Doppler-Velozimetrie (LDV) bestimmt. Die Phasenübergangstemperatur (Tm) der thermosensiblen Liposomen wurde mittels Differential-Scanning-Kalorimetrie (DSC) vermessen. Die Einschlusseffizienz (EE %) von DOX in den liposomalen Formulierungen wurde nach der Reinigung von unverkapseltem DOX mittels UV-VIS-Spektrophotometrie bestimmt. Die Langzeitlagerstabilität in einem wässrigen Medium und die Kurzzeitstabilität in einem serum-ergänzten Zellkulturmedium von DOX-TSL wurden durch DLS und LDV verfolgt und weiter analysiert. Morphologische Merkmale der einzelnen DOX-TSL Formulierungen wurden mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) vor und nach der Temperaturerhöhung bzw. der Wirkstofffreisetzung visualisiert. Die Ergebnisse zeigten eine gut getrennte, kugelförmige Struktur von DOX-TSL. Die AFM-Ergebnisse waren vergleichbar mit der Größenverteilung, die mittels DLS erhalten wurde. Die Ergebnisse der DLS und LDV Analytik zeigten eine einheitliche mono-disperse Größenverteilung von DOX-TSL Liposomen. Diese blieb für sechs Wochen in einer wässrigen Lagerlösung und für 24 Stunden in einem serum-ergänzten Zellkulturmedium erhalten. Die Phasenübergangstemperatur Tm von DOX-TSL Liposomen wurde mittels DSC bei 39,8 °C bestimmt. Eine leichte Hyperthermie bei 40 °C wurde zur Auslösung der Freisetzung gewählt. Vor Erhöhung der Temperatur über Tm zeigte DOX-TSL intakte Strukturen, während nach Erwärmung die Integrität von DOX-TSL zerstört wurde. Zeitgleich mit der Verformung des Liposoms kam es zur Freisetzung des eingekapselten DOX. DOX-TSL wurde weiterhin auf MDA-MB-231 Sphäroiden angewendet, um ihre Wirksamkeit in einem 3D-Zellkulturmodell zu bewerten. Die Quantifizierung erfolgte mittels 3D-Zellviabilitätstests und Live/Dead-Färbetest, welche die erhöhte Zytotoxizität von DOX-TSL auf Sphäroide bei erhöhten Temperaturen (40, 41 und 42 °C) zeigten. Die Penetrationsfähigkeit von DOX auf Sphäroide war temperaturabhängig, wobei höhere Temperaturen (40 °C) eine tiefere Eindringung ermöglichten als bei 37 °C. Das zweite Projekt befasste sich mit der Auslösung der DOX-TSL-Medikamentenfreisetzung unter Verwendung von Nahinfrarot (NIR)-Bestrahlung. Um DOX-TSL Liposomen für NIR sensibel zu machen, wurden Indocyaningrün (ICG) und DOX in thermosensible Liposomen eingeschlossen. NIR-Bestrahlung führte effektiv zur Liposomenstörung und löste damit die Freisetzung von DOX am Tumorort aus. Zusammenfassend zeigten die entwickelten thermosensiblen Liposomen mit DOX-Einschluss eine hohe Wirksamkeit gegenüber 3D-Zellkulturmodellen als Tumormodelle. Durch die Integration von ICG wurden phototherapeutische Eigenschaften in das neue Wirkstoffträgersystem (ICG/DOX-mTSL) eingeführt, was das Potenzial bietet, die Behandlungspräzision am Zielort zu verbessern. Weitere Studien an 3D-Zellkulturmodellen unter physiologischeren Bedingungen sind vielversprechend und könnten ein neues Kapitel für die Arzneimittelbewertung in der 3D-Zellkultur eröffnen.