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Mutagenese des endogenen TP53-Lokus durch CRISPR/Cas9-vermittelte homologe Rekombination & Base Editing in Lungenkarzinomzellen
Das Bronchialkarzinom ist eine der häufigsten Tumorarten und der führende Grund Krebs-assoziierter Sterbefälle weltweit. In bis zu 70 % aller Bronchialkarzinome liegt das Tumorsuppressorgen TP53 mutiert vor. Ein besseres Verständnis des Genprodukts p53 und dessen Mutanten ist somit ein essenzieller...
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| 1. Verfasser: | |
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| Beteiligte: | |
| Format: | Dissertation |
| Sprache: | Deutsch |
| Veröffentlicht: |
Philipps-Universität Marburg
2023
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| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | PDF-Volltext |
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| Zusammenfassung: | Das Bronchialkarzinom ist eine der häufigsten Tumorarten und der führende Grund Krebs-assoziierter Sterbefälle weltweit. In bis zu 70 % aller Bronchialkarzinome liegt das Tumorsuppressorgen TP53 mutiert vor. Ein besseres Verständnis des Genprodukts p53 und dessen Mutanten ist somit ein essenzieller Schritt zur Verbesserung der Prognose von Patienten und dadurch Teil intensiver Forschung.
Dafür wurde im Rahmen dieser Arbeit über mehrere Schritte ein Zellklon der Bronchialkarzinom-Zelllinie NCI-H460 (H460) generiert, an dem zukünftig eine effiziente Mutagenese des endogenen TP53-Lokus durch CRISPR/Cas9 und homologe Rekombination (homology directed repair, HDR) durchgeführt werden kann. Zunächst wurde mit dieser Methodik eine zusätzliche Sequenz, eine sogenannte LSL (LoxP-Stop-LoxP) - Kassette, in ein TP53-Allel eingebaut. Die anderen beiden TP53-Allele wurden ausgeschaltet, sodass eine monoallelische TP53-Expression erreicht wurde. Das Allel mit der LSL-Kassette konnte anschließend effizient editiert werden und das Verhalten einzelner TP53-Mutanten sowie eine saturierte Mutagenese des hotspot-Codons R175 wurden observiert. Hierfür wurde die zelluläre Fitness der Mutanten unter Behandlung mit dem Mdm2-Inhibitor Nutlin-3a, der physiologisch die p53-Antwort aktiviert, observiert. Mithilfe dieses Zellklons kann so in zukünftigen Experimenten erstmals das Verhalten jeder einzelnen klinisch auftretenden Mutation von p53 auf physiologischem Expressionslevel und innerhalb einer physiologischen Genstruktur analysiert werden. Durch diese vollständige Charakterisierung können schlussendlich Therapieschemata optimiert werden, um jedem Patienten unter Berücksichtigung der individuell auftretenden TP53-Mutation eine geeignete Therapie zu ermöglichen.
Des Weiteren wurde eine Mutagenese von TP53 durch die Verwendung eines Base Editors durchgeführt. Dieser besteht aus einer Cas9-Nickase, die mit einer APOBEC3A-Desaminase verknüpft ist. Damit konnten gezielt und mit einer Effizienz von über 90 % Cytosin-zu-Thymin Transitionen erreicht werden. In dieser Arbeit wurde zunächst das hotspot-Codon R273 von TP53 in H460- und HCT116-Zellen, einer Kolonkarzinom-Zelllinie, erfolgreich editiert. Zusätzlich wurde in HCT116-Zellen eine Mutagenese von Exon 8 von TP53 durchgeführt, bei der jede verfügbare PAM-Sequenz in diesem Bereich durch eine entsprechende sgRNA als Ziel erfasst wurde. Insgesamt konnte mit dem Base Editor eine gezielte Genomeditierung mit hoher Effizienz beobachtet werden. |
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| DOI: | 10.17192/z2023.0396 |