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Sequenzierung der Antigen-bindenden Region von natürlich vorkommenden alpha-Synuklein-reaktiven Autoantikörpern
Bei dem idiopathischen Parkinson-Syndrom handelt es sich nach der Alzheimer-Erkrankung um die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung, deren Prävalenz aufgrund der immer älter werdenden Bevölkerung noch weiter zunehmen wird. Rigor, Tremor und Bradykinese sind die Hauptsymptome dieser Erkrankung,...
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| 1. Verfasser: | |
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| Beteiligte: | |
| Format: | Dissertation |
| Sprache: | Deutsch |
| Veröffentlicht: |
Philipps-Universität Marburg
2023
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| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | PDF-Volltext |
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| Zusammenfassung: | Bei dem idiopathischen Parkinson-Syndrom handelt es sich nach der Alzheimer-Erkrankung um die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung, deren Prävalenz aufgrund der immer älter werdenden Bevölkerung noch weiter zunehmen wird. Rigor, Tremor und Bradykinese sind die Hauptsymptome dieser Erkrankung, welche 1817 erstmals von James Parkinson beschrieben wurde. Die motorischen Symptome lassen sich auf den Untergang dopaminerger Neurone in der Substantia nigra, eine den Basalganglien zugeordnete Region des Mittelhirns, zurückführen. Der Substantia nigra wird unter anderem eine Beteiligung an motorischen Funktionen, Lernprozessen, Koordination und der Kognition zugeschrieben. Das histopathologische Charakteristikum des idiopathischen Parkinson-Syndroms sind intraneurale Proteineinschlüsse, die sogenannten Lewy-Körperchen. Diese Einschlüsse bestehen zum Großteil aus aggregiertem, fehlgefaltetem alpha-Synuklein. Über welche Mechanismen diese Lewy-Körperchen dopamin-erge Neuronen schädigen, ist nicht abschließend geklärt.
Die bisherige Therapie des idiopathischen Parkinson-Syndroms mit Levodopa zielt darauf ab, das dopaminerge Defizit auszugleichen und somit vor allem die motorischen Symptome weitestgehend zu kontrollieren. Eine krankheitsmodifizierende oder gar kurative Therapie steht aktuell nicht zur Verfügung. Erfolgversprechende Therapieansätze bestehen in der passiven Immunisierung mit gegen alpha-Synuklein gerichteten Antikörpern. In diesem Zusammenhang konnten natürlich vorkommende Autoantikörper identifiziert werden, welche pathologisch aggregierte Proteine erkennen, deren mikrogliale Aufnahme fördern und somit deren Ablagerung verhindern können. Spezifische alpha-Synuklein-reaktive natürlich vorkommende Autoantikörper können mittels Affinitätschromatographie aus kommerziell erwerblichen intravenösen Immunglobulinen der Klasse IgG isoliert werden. Da es sich bei intravenösen Immunglobulinen der Klasse IgG jedoch um eine begrenzte und teure Ressource handelt, wäre eine Methode zur Herstellung von alpha-Synuklein-reaktiven natürlich vorkommenden Auto-antikörpern, unabhängig von intravenösen Immunglobulinen der Klasse IgG, von Vorteil.
Natürlich vorkommende Autoantikörper sind Bestandteil des humanen Antikörperpools und werden von B1-Lymphozyten gebildet. Diese B1-Lymphozyten können durch für sie charakteris-tische Oberflächenantigene von anderen B-Lymphozyten unterschieden werden. Das Ziel dieser Arbeit war es, eine Methode zu entwickeln, die eine Isolation derjenigen B1-Lymphozyten erlaubt, welche alpha-Synuklein-reaktive natürlich vorkommende Autoantikörper produzieren und aus deren Antigen-bindende Domäne zu sequenzieren. Die Grundlage hierfür war Spenderblut neurologisch gesunder Spenderinnen und Spender. Nach der Aufreinigung des Blu-tes mittels Dichtegradienten-Zentrifugation wurden B-Lymphozyten mit Hilfe einer Magnet-Aufreinigung von den anderen Zellen getrennt. Fluoreszenz-Aktivierte-Zellsortierung erlaubte es, die Population der B1-Lymphozyten, welche alpha-Synuklein-reaktive natürlich vorkommen-de Autoantikörper produzieren, weiter zu charakterisieren. Anschließend erfolgte eine Einzelzell-Sortierung der gewünschten B1-Lymphozyten. Die Antikörper-kodierenden Basen-Sequenzen aus den einzelnen Zellen wurden durch eine Einzelzell-Reverse-Transkription-Polymerasekettenreaktion erhalten und mit Hilfe von Gen-Datenbanken in Aminosäure-sequenzen umgeschrieben.
Außerdem erfolgte eine phylogenetische Analyse der variablen Regionen von leichten und schweren Ketten der Antikörper-Sequenzen, welche insofern ein plausibles Ergebnis ergab, als dass sie sich mit den Erkenntnissen vorheriger Studien in Bezug auf die verwendeten Keimbahngen-Familien von Tau-reaktiven natürlich vorkommenden Autoantikörpern deckt. Eine genaue Aufklärung der Herkunft der sequenzierten alpha-Synuklein-reaktiven natürlich vorkommenden Autoantikörper ist allerdings für die eventuelle therapeutische Anwendung weniger von Bedeutung.
Es war möglich aus dem Blut von neurologisch Gesunden alpha-Synuklein-reaktive natürlich vorkommende Autoantikörper produzierende B1-Lymphozyten zu isolieren und aus diesen spezifischen B1-Lymphozyten die Antigen-bindende Region zu gewinnen und zu sequenzieren.
Um nun einen monoklonalen Antikörper basierend auf der genetischen Information dieser natürlich zirkulierenden Antikörper zu erhalten, sollen in Zukunft die drei in den Analysen als am aussichtsreichsten identifizierten Sequenzen aus den Zellen 20160422_B3, 20160426_B2 und 20160427_C3 in einen geeigneten Expressionsvektor eingebracht werden. Mit diesem Konstrukt sollen humane embryonale Nierenzellen der Zelllinie 293 transfiziert werden. Die so erhaltenen monoklonalen Antikörper müssen anschließend auf ihre Bindungseigenschaften zu alpha-Synuklein, ihre therapeutische Wirksamkeit und mögliche Nebenwirkungen untersucht werden.
Es besteht die Möglichkeit, dass zukünftig ein durch dieses Protokoll entwickelter, monoklonaler Antikörper, der auf einem alpha-Synuklein-reaktiven natürlich vorkommendem Autoantikörper basiert, zur passiven Immunisierung eingesetzt werden kann, indem er fehlgefaltetes α-Syn bindet und so eine Oligomerisierung und die Bildung von Lewy-Körpern verhindert, sodass die Krankheitsprogression aufgehalten werden kann. |
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| DOI: | 10.17192/z2023.0378 |