Investigation on the biosynthesis of polyketides in two Penicillium strains

Sekundärmetabolite, eine spezielle Gruppe von Naturstoffen, besitzen wichtige biologische Aktivitäten in Organismen, besonders jene aus Pflanzen, Bakterien und Pilzen. Bisher wurden verschiedenste Naturstoffe mit außergewöhnlichen Strukturen aus Pilzen isoliert. Diese meisten dieser Substanzen können anhand ihrer biosynthetischen Herkunften in vier Hauptklassen unterteilt werden: Polyketide, Peptide, Alkaloide und Terpenoide. Polyketide haben nicht nur die Medizin revolutioniert, sondern auch unser Leben drastisch verbessert, da aus dieser Klasse wichtige Arzneistoffe gegen Krebs, pathogene Organismen und Autoimmunerkrankungen hervorgingen. Fortschritte bei Sequenzierungstechnologien und der Bioinformatik haben die Aufklärung von Biosynthesewegen in Pilzen ermöglicht. Die strukturelle Vielfalt der Naturstoffe beginnt mit der Bildung der jeweiligen Grundgerüste, die durch verschiedene sogenannte Backbone-Enzyme unter Verwendung von Bausteinen aus dem Primärmetabolismus hergestellt werden. Das Kohlenstoff-Grundgerüst der Polyketide wird beispielsweise von Polyketid-Synthasen (PKSs) aus Acetyl-Coenzym A aufgebaut. Bei der Biosynthese der Grundgerüste folgen PKSs einer einfachen Abfolge und stellen eine der am meisten untersuchten Enzymklassen der letzten Jahrzehnte dar. Pilzliche aromatische Polyketide werden hauptsächlich von nicht-reduzierenden Polyketid-Synthasen (NRPKSs) gebildet, die keine reduktiven Domänen besitzen. Nachfolgende Veränderungen der Grundstrukturen werden von modifizierenden Enzymen, z.B. Transferasen oder Oxidoreduktasen katalysiert, was zu stark unterschiedlichen und komplexen Endprodukten führt. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei NRPKS-Gene aus Penicillium crustosum identifiziert und deren Funktion mittels heterologer Expression, Deletion, Austausch von Domänen in Enzymen und Fütterungsversuche aufgeklärt. Expression des NRPKS-Gens pcr9304 in dem etablierten und häufig verwendeten Stamm Aspergillus nidulans führte zur Produktion von drei Isocumarin-Analoga, welches dessen Funktion als Isocumarin-Synthase bewies. Durch Zufütterung von Vorstufen konnte nachgewiesen werden, dass endogene Enzyme aus A. nidulans das PK-Grundgerüst weiter mittels Hydroxylierung und Methylierung modifizieren. Diese Beobachtungen bestätigten, dass unvorhergesehene Modifikationen durch den heterologen Expressionsstamm auftreten können. Heterologe Expression des zweiten NRPKS-Gens oesA aus P. crustosum führte zur Identifizierung von 3-Orsellinoxypropansäure. Deletion und Rekombination von Domänen bestätigten, dass OesA, mit einer SAT-KS-AT-ACP1-ACP2-TE Domänstruktur, nicht nur die Entstehung von Orsellinsäure, sondern auch den Transfer der 3-Hydroxypropansäure katalysiert. Dies bewies dessen Rolle als ein bi-funktionelles Enzym, nämlich als Orsellinsäure-Synthase und -Transferase. Beide ACP-Domänen tragen unabhängig voneinander und komplementär zur Produktsynthese bei. Durch Isotopenmarkierung konnte bewiesen werden, dass nur der Orsellinyl-Rest der 3-Orsellinoxypropansäure aus Acetat stammt. In Kooperation mit Bastian Kemmerich wurde die Biosynthese der Annullatine in Penicillium roqueforti aufgeklärt. Das anu Cluster mit elf Genen wurde durch genome mining in P. roqueforti identifiziert. Die Beteiligung des anu Clusters an der Biosynthese von Annullatin D, welches ein Dihydrobenzofuran-Lacton Grundgerüst besitzt, sowie dessen Derivaten wurde durch heterologe Expression des kompletten Clusters in A. nidulans bestätigt. Eine Kombination aus enzymatischen Untersuchungen in vitro und heterologer Expression wurde durchgeführt, um die Entstehung des fünfgliedrigen Lactonrings in Annullatin D aufzuklären. Das aromatische Grundgerüst wird durch die vollständig reduzierende Polyketid-Synthase AnuA unter Beteiligung von zwei weiteren Enzymen, AnuBC, gebildet. Danach wird das Polyketid durch das Cytochrom P450 AnuE an der C5-Alkylkette hydroxyliert. Die Prenyltransferase AnuH installiert anschließend eine Isoprenyl-Gruppe am Benzolring. Enzymatischer oder nicht-enzymatischer Dihydrobenzofuran-Ringschluss zwischen der Prenyl- und der phenolischen Hydroxylgruppe führt zu zwei Diastereomeren. Das (2S, 9S)-Isomer wird im Anschluss daran durch das BBE-ähnliche Enzym AnuG zu Annullatin D umgewandelt, welches den Ringschluss des fünfgliedrigen Lactonrings katalysiert. Das (2R, 9S)-Isomer ist höchstwahrscheinlich instabil und wird vermutlich direkt durch die kurzkettige Dehydrogenase/Reduktase AnuF zu Annullatin F oxidiert. Diese Arbeit zeigt somit einen hoch effizienten und programmierten Biosyntheseweg für die Annullatine. Trotz der faszinierenden Strukturen und den biologischen Aktivitäten wurden bisher keine biosynthetischen Studien zu Annullatinen, vor allem im Hinblick auf die Entstehung des Lactonrings des Annullatin D, berichtet. Darüber hinaus wurde ein neues, BBE-ähnliches Enzym identifiziert, welches die oxidative Lactonbildung zwischen zwei Hydroxylgruppen katalysiert.