Importance of the senescence-associated secretory phenotype (SASP) for the radio-resistance of HNSCC cell lines after particle irradiation

Die Strahlentherapie mit Photonen ist die wichtigste Behandlungsoption für lokal fortgeschrittene HPV-negative Plattenepithelkarzinome des Kopfes und Halses (HNSCC). Diese Behandlung kann als präzises und effizientes Instrument zur Abtötung von Tumorzellen eingesetzt werden. Jedoch kommt es trotz de...

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Main Author: Tiwari, Dinesh Kumar
Contributors: Schötz, Ulrike (Dr.) (Thesis advisor)
Format: Doctoral Thesis
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2021
Subjects:
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Description
Summary:Die Strahlentherapie mit Photonen ist die wichtigste Behandlungsoption für lokal fortgeschrittene HPV-negative Plattenepithelkarzinome des Kopfes und Halses (HNSCC). Diese Behandlung kann als präzises und effizientes Instrument zur Abtötung von Tumorzellen eingesetzt werden. Jedoch kommt es trotz der Anwendung hoher Dosen über 70 Gy häufig zu einem Therapieversagen, was auf die inhärente und erworbene Radioresistenz der Tumorzellen zurückzuführen ist. Es wird davon ausgegangen, dass diese Radioresistenz stark mit der durch ionisierende Strahlung induzierten Seneszenz zusammenhängt. Seneszente Zellen sind in der Lage SASP-Faktoren (senescence-associated secretory phenotype) zu sezernieren, welche die zelluläre Radioresistenz verstärken könnten und damit die Wirkung der Strahlung, Tumorzellen abzutöten, verringern würden. Ziel dieses Projekts war es, die zellulären und molekularen Mechanismen dieser Seneszenz-induzierten Strahlenresistenz in HPV-neg. HNSCC-Zellen besser zu verstehen. Die Experimente wurden mit fünf verschiedenen HPV-neg. Zelllinien (Cal27, Cal33, UPCISCC040, UPCISCC099, UPCISCC131) durchgeführt, um ein breites Spektrum an Radiosensitivität abzudecken, welches ein typisches Charakteristikum dieser Entität ist. Die Mechanismen wurden für Röntgenstrahlen und zum ersten Mal auch für 12C-Ionen untersucht, welche eine weitere hochpräzise Strahlentherapie darstellt, die am Marburger Ionenstrahl-Therapiezentrum (MIT) durchgeführt werden kann. Die folgenden Ergebnisse wurden erzielt: 1. Die mittels Koloniebildungstest ermittelte zelluläre Radiosensitivität mit 12C-Ionen war im Vergleich zu Röntgenstrahlen mit einer RBW10 von ~ 2-3 deutlich höher, was auch frühere Ergebnisse bestätigt. 2. Eine aktive DSB-Reparatur, die durch immunfluoreszierende Visualisierung von γH2AX/53BP1-Foci untersucht wurde, wurde in allen Zelllinien und auch nach Röntgen- und 12C-Bestrahlung beobachtet. Die Reparaturkapazität war jedoch nach 12C-Bestrahlung deutlich geringer. 3. Die Seneszenz wurde mit einer auf einem Durchflusszytometer basierenden Methode zum Nachweis der Seneszenz-assoziierten β-Galaktosidase-Aktivität nach Röntgenbestrahlung und zum ersten Mal auch nach 12C-Bestrahlung untersucht. Nach beiden Bestrahlungsarten nimmt die Seneszenz mit der Zeit und der Dosis zu. Jedoch wurde nach 12C-Bestrahlung ein stärkeres Endlevel erreicht. Dieser Grad der Seneszenz korrelierte gut mit der jeweiligen zellulären Strahlenresistenz, allerdings war dieser Zusammenhang bei 12C-Bestrahlung viel steiler. Bei Röntgenbestrahlung korreliert ein mäßiger Anstieg der Seneszenz mit einem starken Anstieg der Strahlenresistenz, während im Gegenteil bei 12C-Bestrahlung ein starker Anstieg der Seneszenz mit einem geringen Anstieg der Strahlenresistenz assoziiert ist. Dieses Ergebnis zeigt zum ersten Mal, dass der Einfluss der Seneszenz auf die zelluläre Strahlenresistenz bei 12C-Ionen im Vergleich zu Röntgenstrahlen geringer zu sein scheint. 4. Das Genexpressionsprofil der SASP-Faktoren wurde sowohl mittels qRT-PCR als auch mittels RNA-seq gemessen. Nach beiden Bestrahlungsarten wurde eine starke Induktion von SASP-Faktoren mit sehr ähnlicher Dynamik beobachtet. Mit Hilfe einer Hauptkomponentenanalyse (PCA) wurde eine klare Unterscheidung zwischen den fünf verwendeten Zelllinien festgestellt. Jede Zelle ist durch ein spezifisches Profil von SASP-Faktoren gekennzeichnet. Ebenso zeigte sich eine starke Induktion der SASP-Faktoren nach Bestrahlung. 5. Für IL1α und IL1β wird zum ersten Mal gezeigt, dass eine starke Assoziation zwischen der Genexpression und der Radioresistenz sowie Seneszenz sowohl nach X- als auch nach 12C-Bestrahlung besteht. Die mittels ELISA gemessene Sekretion von IL1β im Überstand der Zellkulturen nimmt im Verlauf der Zeit nach der Bestrahlung zu und war nachweislich nach 12C-Bestrahlung stärker. Diese Sekretion war bei radioresistenten Zelllinien deutlich erhöht. 6. Eine mechanistische Studie wurde für IL1α und β durchgeführt, in welcher ein Knockdown durch eine siRNA-Transfektion herbeigeführt wurde. Überraschenderweise wirkte sich dieser Knockdown weder auf die zelluläre Radiosensitivität noch auf die DSB-Reparatur oder die Seneszenz aus. Dies galt sowohl für X- als auch für 12C-Bestrahlung und nicht nur für einen einzelnen, sondern auch für einen kombinierten Knockdown dieser beiden Faktoren. 7. Diese Daten demonstrieren zum ersten Mal, dass die beiden wichtigen SASP-Faktoren IL1α und β, obwohl sie stark mit der zellulärer Strahlenresistenz, DSB-Reparatur und Seneszenz assoziiert sind, an keinem dieser Prozesse funktionell beteiligt sind. Nach aktuellem Kenntnisstand ist dies die erste Studie, die den Einfluss der spezifischen SASP-Faktoren IL1α und β im Zusammenhang mit Seneszenz nach X- sowie nach 12C-Bestrahlung in HNSCC-Zelllinien untersucht. Aufgrund der gewonnenen Daten können IL1α/β nun als Faktoren ausgeschlossen werden, die hauptverantwortlich die Seneszenz und damit die zelluläre Radioresistenz kontrollieren. Zukünftige Forschungen müssen sich auf andere Faktoren konzentrieren, die für diese biologischen Endpunkte relevant sein können.
Physical Description:109 Pages
DOI:https://doi.org/10.17192/z2022.0097