Characterization of RNA interactions of dMi-2

Chromatin wird in einem dynamischen entspannten oder unterdrückten Zustand gehalten, so dass DNA-Bindungsstellen für die Transkriptionsmaschinerie entweder zugänglich oder verschlossen sind. Auf diese Weise wird die Genexpression reguliert. Es gibt mehrere Chromatinregulatoren, darunter ATP-abhängige Chromatin-Remodeler, die dazu beitragen, die Konformation des Chromatins zu verändern oder zu modulieren, um die Genexpression zu unterdrücken oder zu ermöglichen. Neuere Studien haben mehrere Chromatin-Remodeler in die RNA-Bindung einbezogen. Die genaue Funktion dieser RNA-Bindungseigenschaft wird jedoch aufgrund unseres begrenzten Verständnisses der Funktion intensiv diskutiert. In dieser Arbeit wurde dMi-2, ein ATP-abhängiger Chromatin-Remodeler, auf seine Interaktion mit RNA untersucht und ein Modell für die Auswirkungen der RNA-Bindung auf seine Funktion vorgeschlagen, das die Hypothese unterstützt, dass die RNA-Bindung die Funktion von Chromatin-Remodelern moduliert. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden die RNA-Bindungseigenschaften von dMi-2 in vitro charakterisiert. dMi-2 bildete biochemisch stabile Komplexe mit mehreren RNAs unterschiedlicher Sequenz. Dies deutete auf eine Bindung promiskuitiver Natur hin. Allerdings band dMi-2 einige RNAs mit höherer Affinität im Vergleich zu anderen. Weiterhin wurden die RNA-Bindungsregionen in dMi-2 kartiert. Die wichtigsten RNA-Bindungsregionen von dMi-2 befanden sich in seinem N-terminalen Teil. Die Analyse der Art der Sequenzen, an die dMi-2 gebunden hat, ergab eine Präferenz für G-reiche RNA. Im zweiten Teil dieser Studie wurde die in vivo RNA-Bindung von dMi-2 genomweit charakterisiert. Das iCLIP-Experiment (individual nucleotide-resolution crosslinking and immunoprecipitation) rekapitulierte die promiskuitive Natur der RNA-Bindung, die in den in vitro-assays gefunden wurde. iCLIP enthüllte tausende von verschiedenen dMi-2-bindenden RNAs. Weitere Analysen zeigten, dass dMi-2 fast ausschließlich in der Nähe des 3'-Endes der mRNAs interagierte. An der Vernetzungsstelle waren G-Nukleotide angereichert. Im dritten Teil dieser Arbeit wurden die Auswirkungen der RNA-Bindung auf die Funktion von dMi-2 untersucht. Es wurde gezeigt, dass die RNA-Bindung die Remodeling-Aktivität von dMi-2 hemmt. Weitere Analysen zeigten, dass die RNAs, die dMi-2 mit höherer Affinität banden, auch dessen Remodeling-Aktivität besser hemmten als die RNAs, die mit geringerer Affinität banden. Die biochemische Analyse zeigte, dassder Abbau der RNA zu einer erhöhten Chromatinbesetzung von dMi-2 führte. Ebenso führte die Inhibition der Transkription in vivo zu einer erhöhten Chromatinbesetzung von dMi-2. Zusammenfassend unterstützen die Ergebnisse dieser Arbeit ein Modell, das nahelegt, dass die dMi-2-RNA-Interaktion eine Hemmung der Remodeling-Funktion von dMi-2 bewirkt. Dies könnte durch die Verdrängung von dMi-2 aus dem Chromatin bei RNA-Interaktion verursacht werden. An aktiv transkribierten Genen löst die RNA dMi-2 vom Chromatin ab und an repressiven Genen hat dMi-2 eine erhöhte Chromatinbesetzung aufgrund des Mangels an RNA. Diese Arbeit trägt zum Verständnis der Rolle der RNA-Interaktion bei der Modulation der Funktion von Chromatin-Remodelern bei.