Fragment-basierte Leitstruktursuche am Beispiel der Proteinkinase A

In den letzten Jahren kommt in der industriellen Forschung der Hochdurchsatz-Musterung von großen Molekülbibliotheken zur Findung neuer biologisch aktiver Substanzen eine immer größere Bedeutung zu. Diese Bibliotheken zeichnen sich durch eine hohe Diversität aus, sodass ein möglichst großer chemisch...

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Main Author: Oebbeke, Matthias
Contributors: Klebe, Gerhard (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2021
Subjects:
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:In den letzten Jahren kommt in der industriellen Forschung der Hochdurchsatz-Musterung von großen Molekülbibliotheken zur Findung neuer biologisch aktiver Substanzen eine immer größere Bedeutung zu. Diese Bibliotheken zeichnen sich durch eine hohe Diversität aus, sodass ein möglichst großer chemischer Raum abgedeckt wird. Bezüglich ihres Molekulargewichts gleichen die untersuchten Moleküle oftmals dem eines finalen Wirkstoffs. Da hier eine Überlagerung verschiedener Effekte der einzelnen Substituenten auftritt, können diese nicht separat voneinander betrachtet werden, sodass die Wirkung der einzelnen Substituenten und somit die weitere Optimierung nur schwer abgeschätzt werden kann. Beim Fragment-basierten Ansatz hingegen werden kleine Moleküle gefunden, welche in Folge besser an das Zielprotein angepasst werden können. Das ist damit zu begründen, dass Fragmente relativ ungestört mit optimaler Orientierung an das Zielprotein binden können. Ein Beispiel für die sukzessive Erweiterung eines Fragments hin zu einem Binder im nanomolaren Affinitätsbereich ist in Kapitel 7 gegeben. Die vorangegangenen Untersuchungen zeigten bereits verschiedene Wirkstoffkandidaten mit hoher Affinität zu der Proteinkinase A. Allerdings wurden die Verbindungen lediglich als racemische Gemische erhalten, sodass das affinste Derivat in einer neuen Synthese stereoselektiv hergestellt wurde. Allerdings wurde im Zuge dieser Arbeit erneut nur die S-konfigurierte Verbindung in verschiedenen Protein-Ligand-Komplexstrukturen gefunden. Dieses deutet auf eine Verunreinigung der vermeintlich stereoselektiv hergestellten Verbindungen mit dem jeweils anderen Enantiomer hin. Dabei konnte nicht festgestellt werden, ob eine teilweise Racemisierung durch die erforderlichen Synthesebedingungen erfolgte. Abschließend wird aus den röntgenkristallographischen Ergebnissen vermutet, dass das S-konfigurierte β-Aminosäure-Derivat die höchste Affinität zu der PKA aufweist. In einem weiteren Projekt (Kapitel 6) erfolgte ebenfalls eine Erweiterung der Strukturen, welche aus einer initialen in silico Durchmusterung einer Fragment-Bibliothek als Treffer identifiziert wurden. Die Fragment-Bibliothek stellt hierbei eine Alternative zu üblichen Bibliotheken dar, da die Fragmente aus Naturstoffen abgeleitet sind. Mit dieser wurde die Hoffnung verknüpft neue Leitstrukturen für die Proteinkinase A zu finden. Aus 22 Folgeverbindungen konnten in einer Versuchsreihe mit einem FRET-basierten Assay neun Verbindungen gefunden werden, welche eine inhibitorische Wirkung auf die PKA haben. Dieses entspricht einer Trefferquote von 41%. Allerdings sind bisher die kristallographischen Versuche, die Liganden mithilfe der Soaking-Methode in der aktiven Tasche der PKA zu populieren, gescheitert. Ein Grund für das Ausbleiben einer Bindung nach der Soaking-Methode, könnte der sterische Anspruch der untersuchten Moleküle darstellen, welcher die Diffusion durch die Lösungsmittelkanäle verhindert. Daher wurden Kokristallisationsversuche gestartet, welche eine Bildung der Protein-Ligand-Komplexe ermöglichen sollte. Für jeden Liganden wurde je ein Kokristallisationsansatz angefertigt, von dem in sieben Fällen Kristalle erhalten werden konnten. Die röntgenkristallographischen Messungen und die Interpretation der Daten ergaben einen Treffer. Weiterhin können noch Anpassungen der Kristallisationsbedingungen vorgenommen werden, um weitere Kristalle der Protein-Ligand-Komplexe zu erhalten. Bisher konnte ein Protein-Ligand-Komplex röntgenkristallographisch beobachtet werden. In den weiteren Projekten wurden Fragmente untersucht, die noch nicht erweitert wurden. So konnten in Kapitel 2 die Merkmale der ATP-Bindetasche der Proteinkinase A ausgeleuchtet werden, indem hier für eine Reihe von Fragmenten die Wechselwirkungen mit der Scharnierregion der Kinase untersucht wurden. Diese Studie zeigt, dass sowohl eine Carbonsäure- und Carboxamidgruppe als auch eine Amidinogruppe im ungeladenen Zustand das H-Brückenbindungsmuster der Scharnierregion erfüllt. Allerdings muss hierfür das Molekül mit einer geeigneten elektronenschiebenden oder -ziehenden Gruppe ausgestattet werden, um den notwendigen Protonierungszustand sicherzustellen. Um solche elektronischen Eigenschaften vorherzusagen, werden allerdings aufwendige quantenmechanische Berechnungen benötigt, die noch nicht routineweise durchführbar sind. Solange können die in diesem Projekt erhaltenen experimentellen Informationen, neben den bestehenden Konzepten, als Anhaltspunkte für Überlegungen zur Erweiterung von initialen Leitstrukturen dienen. In Kapitel 3 wurde das Konzept der Kokristallisation mit dem des Soakings verglichen, indem Strukturen mit verschiedenen Liganden nach beiden Methoden erhalten wurden. Es zeigten sich unterschiedliche Orientierungen der nach beiden Methoden erhaltenen Strukturen. Diese traten vor allem bei Liganden mit mehr Freiheitsgraden auf. Demnach erscheint das Soaking für Fragmente gut geeignet, zumal das die zeit- und ressourcensparende Methode darstellt. Für größere Verbindungen mit mehr Freiheitsgraden erscheint die Kokristallisation die Methode der Wahl, da sie das zuverlässigere Bild darzustellen scheint. Diese Vermutung wurde durch NMR-Studien bekräftigt, sodass wir uns über unsere Aussage im untersuchten Fall sicher sind. Eine röntgenkristallographische Durchmusterung von Bibliotheken chemischer Verbindungen nach der Soaking-Methode stellt vor allem bei der nicht vollständig automatisierten Auswertung und Interpretation der Daten einen großen Aufwand dar. In Kapitel 4 wird eine Methode entwickelt, um die Bindung von chemischen Verbindungen an die Scharnierregion der PKA im Proteinkristall anzuzeigen. Dadurch wird eine unnötige Aufnahme der röntgenkristallographischen Daten im Falle einer ausbleibenden Bindung der zu untersuchenden Verbindungen vermieden. Das Prinzip beruht auf einen fluoreszierenden Reporter-Liganden, welcher zuvor in der Bindetasche des PKA-Kristalls populiert wird. Dieser Kristall zeigt eine Fluoreszenzemission, welche durch das Verdrängen des Reporter-Liganden ausgelöscht werden sollte. Das Auslöschen der Fluoreszenz zeigt eine Bindung des Test-Liganden an, sodass die Vermessung des Kristalls an einer Strahlenquelle sinnvoll ist. In dieser Arbeit konnte Aminofasudil als ein Reporter-Ligand gefunden werden, welcher von Staurosporin und Isochinolin verdrängt werden konnte. Allerdings wies der Kristall im Fall der Verdrängung mit dem Fragment Isochinolin weiterhin eine Fluoreszenzemission auf, die allerdings eine Änderung des Emissionsspektrums hervorrief. Diese Änderung könnte für das Anzeigen einer erfolgreichen Verdrängung und somit für eine erfolgreiche Bindung des zu untersuchenden Liganden genutzt werden. Vermutet wird, dass diese Änderung auf das Verdrängen des Reporter-Liganden aus der Bindetasche der PKA resultiert, welcher vermutlich weiterhin in den Lösungsmittelkanälen des Kristalls vorhanden ist und das veränderte Fluoreszenzemissionsspektrum bewirkt. Die in Kapitel 5 untersuchten Fragmente basieren auf dem natürlichen Substrat ATP der PKA und dem bekannten Wirkstoff Fasudil. Das Ziel war die thermodynamische und kristallographische Bindungscharakterisierung dieser Fragmente an der PKA und die Klärung möglicher Unterschiede. Interessant ist vor allem die kleinste Verbindung der Serie Isochinolin, welche eine unerwartet hohe Affinität zum Zielprotein zeigt. Außerdem bindet diese, im Vergleich zu dem Wirkstoff Fasudil, in einer alternativen Bindungspose, das Isochinolin als Grundgerüst enthält. Diese Untersuchungen zeigen unter anderem, dass die Entwicklung eines Wirkstoffs auf Grundlage von der Kristallstruktur mit Isochinolin eine alternative Erweiterungsstrategie zur Folge gehabt hätte. Eine Erweiterung wäre demnach in 6-Position anstelle der gewählten 5-Position naheliegend gewesen. Außerdem zeigt sich, dass eine bivalente Bindungsweise an der Scharnierregion zu keiner Affinitätsverbesserung führt und diese vor allem bei den schwächer bindenden Fragmenten vorliegt.
Physical Description:219 Pages
DOI:https://doi.org/10.17192/z2021.0112