Evaluation of CRPV based cell systems for the therapeutic studies of papilloma virus associated head and neck cancer

Die vorliegende Studie konzentriert sich auf die Etablierung eines In-vitro-Expressionssystems zur Untersuchung eines Papillomavirus (cottontail rabbit papilloma virus, CRPV) assoziierten Kaninchen-Plattenepithelkarzinoms. Dieses System wurde gewählt, da das CRPV-assoziierte VX2-Karzinom des weißen Neuseelandkaninchens ein etabliertes Tiermodell für menschliche Plattenepithelkarzinome des Kopf- und Halsbereiches (head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC) darstellt. Literaturrecherchen ergaben mehrere Berichte über von VX2-Karzinomen des Kaninchens abgeleitete Zelllinien. Leider wurden diese Zelllinien entweder abgesetzt oder waren nicht ohne weiteres verfügbar. Diese Situation veranlasste uns dazu, unsere eigene VX2-Zelllinie zu generieren, da die Entwicklung einer vom VX2-Karzinom abgeleiteten Zelllinie die Durchführung von In-vitro-Studien ermöglichen würde, wodurch die Anzahl der Tierversuche verringert werden kann. Das 2. Kapitel der Arbeit befasst sich daher mit der Entwicklung und Charakterisierung einer vom VX2-Karzinom abgeleiteten Zelllinie. Hierdurch wurde erhofft, dass diese VX2-Karzinomzelllinie dazu beitragen kann, verschiedene Experimente In-vitro durchzuführen, also noch bevor In-vivo Tests im VX2-Kaninchen-Tiermodell stattfinden. Hierzu wurden VX2-Zellen aus einem VX2-Tumor, welcher aus dem Kaninchenohr herausgeschnitten wurde, isoliert. Man ließ die Zellen unter Standardkulturbedingungen wachsen. Die so generierte VX2-Zelllinie überlebte etwa 150 Passagen, was für Kulturen normaler Zellen zwar länger ist als erwartet jedoch konnte kein permanentes Wachstum erreicht werden. Die Immunfärbung von VX2-Zellen bei initialen Passagen zeigte den fortschreitenden Verlust von Tumor-assoziierten Fibroblasten, was zu einer VX2-Zelllinie mit einer ausgeprägten Proliferationskapazität führte. Die Ergebnisse der Durchflusszytometrie wiesen auf das Vorhandensein von zwei VX2-Zellpopulationen, einer kleinen und einer großen. Nach Sortierung der 2 Zellpopulationen mittels Durchflusszytometrie mit nachfolgender Kultivierung für 5 Tage und anschließender Western-Blot-Analyse konnte gezeigt werden, dass die größere Zell-Subpopulation eine höhere Proliferation aufweist. Eine Echtzeit-PCR wurde durchgeführt, um das Vorhandensein von CRPV E6- und E7-Onkogen-Transkripten in den VX2-Zellen zu bestätigen und zu quantifizieren. Hierzu wurden Primer eingesetzt, die spezifisch zum Nachweis von CRPV E6- und E7-Transkripten geeignet sind. Die Expression verschiedener Proliferationsmarker, Apoptose-assoziierter Gene, EMT (Epitheliale Mesenchymale Transition)-Marker und CRPV E6 & E7-Transkripten wurde sowohl in der VX2-Karzinom-generierten Zelllinie als auch im ursprünglichen VX2-Tumor nachgewiesen. Ein weiteres Ziel, das im 3. Kapitel der Arbeit vorgestellt wird, war die Bewertung therapeutischer Strategien in der generierten VX2-Zelllinie. Zu diesem Zweck wurde die photodynamische Therapie (PDT) als nicht-invasive Behandlungsmethode ausgewählt, um ihre biologischen Auswirkungen auf VX2-Karzinom Zellen zu untersuchen. Liposomal eingekapseltes Curcumin wurde als Photosensibilisator verwendet. VX2-Zellen wurden mit Curcumin-Liposomen allein, PDT allein oder einer Kombination von Curcumin-Liposomen und PDT behandelt. Zytotoxizitätsstudien wie der MTT (3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid) -Test zeigten, dass die Zugabe von PDT die IC50-Werte von Curcumin-Liposomen verringern kann. Störungen der lysosomalen Integrität, Lebend- und Totfärbung und Apoptosetests wurden ausführlich diskutiert. Eine signifikante Verringerung der Koloniebildung und der Migrationsfähigkeit wurde in solchen Zellen beobachtet die sowohl Curcumin-Liposomen als auch PDT ausgesetzt waren. Zusätzlich zur CRPV-assoziierten Kaninchen-VX2-Zelllinie wurden ebenfalls humane Papillomavirus (HPV) -positive Zelllinien wie HeLa (HPV-18-positive Gebärmutterhalskrebs-Zelllinie) und UD-SCC-2 (HPV-16-positive Kopf- und Halskrebs-Zelllinie) in diese Studie einbezogen, um die therapeutischen Wirkungen von mit Curcumin beladenen Liposomen in Verbindung mit einer PDT zu beurteilen. Nach Bewertung verschiedener Parameter unter Verwendung von PDT in Papillomavirus-assoziierten Zelllinien konnte geschlossen werden, dass eine Kombination von Curcumin-Liposomen zusammen mit PDT im Vergleich zu einer Behandlung mit Curcumin-Liposomen oder PDT allein signifikant wirksamer war. Das 4. Kapitel beschreibt einen alternativen Ansatz für die In-vitro-Untersuchung von CRPV-Onkogenen. Rekombinante Säuger-Expressionsvektoren, die CRPV E6- und E7-Onkogene mit und ohne GFP- und RFP-Reportergenen enthielten, wurden erfolgreich durch PCR-Klonierung unter Verwendung von VX2-Karzinom-abgeleiteter RNA als Quelle erzeugt. Rekombinante Klone wurden durch Restriktionsenzymverdau und Sequenzanalyse validiert. Diese Klone wurden transient in COS-7- und VX2-Zellen unter Verwendung von Lipopolyplexen auf Polyethylenimin (PEI) -Basis transfiziert. Die Expression von rekombinanten CRPV E6- und E7-Klonen wurde unter Verwendung verschiedener Techniken bewertet. Mikroskopische Ergebnisse zeigten eine erfolgreiche Expression von CRPV E6- und E7-Genen durch Betrachtung von GFP- und RFP-Reportergenen. Die quantitative PCR zeigte eine signifikante Expression von E6- und E7-mRNA in transfizierten Zelllinien, während die Western-Blot-Analyse die Expression von rekombinanten E7- jedoch nicht von E6-Proteinen zeigte, vermutlich aufgrund des Unvermögens rekombinanter E6-Proteine, sich ausreichend im eingesetzten Lysispuffer zu lösen. Die im 4. Kapitel vorgestellten Ergebnisse bieten eine alternative Plattform für die Untersuchung von Therapieansätzen gegen virale Onkoproteine wie E6 und E7. Mit diesem System könnten die Auswirkungen gezielter antiviraler Therapien durch visuelle Untersuchung unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie bewertet oder in Multiwellplatten-fähigen Fluoreszenzdetektoren quantitativ gemessen werden. Die Wirkung experimenteller Therapien auf das Expressionsniveau viraler mRNA und Proteine könnte über PCR und Western-Blot-Analysen z.B. durch Verwendung von anti-GFP- oder anti-RFP-Antikörpern gemessen werden da derzeit keine gegen CRPV E6- oder E7-Proteine gerichteten Antikörper im Handel verfügbar sind. Zusammenfassend könnte dieses CRPV-Expressionssystem als eine In-vitro-Plattform für die Bewertung eines antiviralen Therapeutikums eingesetzt werden bevor ein In-vivo-Test im CRPV-positiven Kaninchen-VX2-Karzinom, welches als Tiermodell für menschliche HNSCC dient, durchgeführt wird.