Osmotisch bedingter Stress in Bacillus subtilis - C-di-AMP, der Regulator für die Aufnahme osmotischer Schutzsubstanzen?

Bacillus subtilis ist durch seinen Lebensraum in den oberen Schichten des Bodens sich ständig ändernden Umweltbedingungen ausgesetzt. Für die Anpassung an hochosmolare Bedingungen nutzt B. subtilis die salt-out Strategie. Dafür ist die Akkumulation (durch Aufnahme und Synthese) von kompatiblen So...

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Main Author: Hinkel, Doreen
Contributors: Bremer, Erhard (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2020
Subjects:
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:Bacillus subtilis ist durch seinen Lebensraum in den oberen Schichten des Bodens sich ständig ändernden Umweltbedingungen ausgesetzt. Für die Anpassung an hochosmolare Bedingungen nutzt B. subtilis die salt-out Strategie. Dafür ist die Akkumulation (durch Aufnahme und Synthese) von kompatiblen Soluten, ein essenzieller Schritt. Für die Aufnahme gibt es in B. subtilis verschiedene Transporter, wobei drei davon zu den ABC Transportern gehören (OpuA, OpuB und OpuC). Eine Besonderheit dieser ABC Transporter ist die regulatorische CBS Domäne am C-Terminus der ATPase, welche durch Spaltung von ATP den Transport katalysiert. In anderen homologen Transportern konnte gezeigt werden, dass diese Domäne mit dem Second Messenger c-di-AMP interagiert und vermutlich den Transport dadurch abschaltet. C-di-AMP ist insofern interessant, als das es sowohl in B. subtilis als auch in nahe verwandten Organismen die Kaliumaufname, den ersten Schritt der salt-out Strategie reguliert. In dieser Arbeit konnten zunächst die CBS Domänen der drei Transporter erfolgreich heterolog in Escherichia coli exprimiert und gereinigt werden. Im Anschluss daran konnte in vitro mittels zwei verschiedener Methoden gezeigt werden, dass c-di-AMP an die CBS Domänen von OpuB und OpuC, jedoch nicht an die von OpuA bindet. DieWerte für die Affinität von c-di-AMP zu den CBS Domänen lag für beide Systeme Werte im niederen mikromolaren Bereich. Des Weiteren wurden mittels gerichteter Mutagenese in der CBS-Domäne von OpuB Mutanten erzeugt um zu determinieren, welche Aminosäuren an der Bindung beteiligt sind. Es wurden einige interessante Mutanten gefunden, welche in vitro kein c-di-AMP mehr binden. In vivo zeigte sich bei Osmoprotektionsassays zunächst, dass die in vitro getesteten Mutanten keinen Einfluss auf die Funktionsweise des Transporters bei Salzstress im Vergleich zum Wildtyp haben. Auch ein B. subtilis Stamm, welcher OpuB oder OpuC ohne CBS Domäne exprimiert, zeigte keinen veränderten Phänotyp im Wachstum. Eine Analyse des Minimalmediums, welches standardmäßig für B. subtilis verwendet wird, deutete darauf hin, dass die hohe Kaliumkonzentration ein Problem für die eben genannten Wachstumsexperimente sein könnte. Im Verlauf dieser Arbeit konnte keine Mediumzusammensetzung gefunden werden, die eine definiert geringe Menge Kalium enthält und ein Wachstum von B. subtilis unter hochosmolaren Bedingungen erlaubt. Damit konnte die vorausgesagte Funktion von c-di-AMP bei der Bindung an die CBS Domänen in vivo weder bestätigt noch wiederlegt werden. In einem zweiten Teil der Arbeit konnte gezeigt werden, dass die c-di-AMP Konzentration in B. subtilis im oben genannten Minimalmedium im niedrigen mikromolaren Bereich liegt und sich bei hyperosmotischem Stress nicht signifikant verändert. Kombinationen von Knock-Outs der c-di-AMP synthetisierenden Enzyme führten teilweise zu einer Reduktion der c-di-AMP Konzentration. Es konnte allerdings nicht gezeigt werden, ob eines der Enzyme bei Salzstress eine gesonderte Rolle spielt. Diese Arbeit liefert damit eine erste Tendenz, inwiefern c-di-AMP bei der Regulation der Aufnahme von kompatiblen Soluten eine Rolle spielt und zeigt, dass es ein Zusammenspiel verschiedener Faktoren ist, welche bei der Adaption an Salzstress zum Tragen kommen. In einem kleinen Exkurs des Projekts wurde das zytoplasmatische Volumen von B. subtilis mittels verschiedener Mikroskopie-Techniken bestimmt. Salzstress in Form von 1,2 M NaCl führt zu einer Verkleinerung der Zellen insgesamt, aber interessanterweise zu einer Verdickung der Zellhülle. Dieser Effekt kann durch die Zugabe des kompatiblen Soluts Glycinbetain vermieden werden. Für die einzelne Zelle bedeutet das, dass Konzentrationen beispielsweise von c-di-AMP oder kompatiblen Soluten dadurch wesentlich höher sind, als unter der Annahme, dass das zytoplasmatische Volumen relativ gleich bleibt unabhängig von der Osmolarität der Umgebung.
Physical Description:133 Pages
DOI:https://doi.org/10.17192/z2020.0515