Biochemische Charakterisierung von Ectoin-Biosynthese-Enzymen

Die Akkumulation von kompatiblen Soluten ist eine unter Mikroorganismen weit verbreitete Strategie zum Schutz vor dem Einfluss von hyperosmotischen Bedingungen in der Umgebung. Ectoin und sein Derivat 5-Hydroxyectoin sind prominente Mitglieder dieser Stressprotektiva. Aufgrund ihrer Eigenschaften we...

Full description

Saved in:
Bibliographic Details
Main Author: Richter, Alexandra
Contributors: Bremer, Erhard (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2019
Subjects:
Online Access:PDF Full Text
Tags: Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
Description
Summary:Die Akkumulation von kompatiblen Soluten ist eine unter Mikroorganismen weit verbreitete Strategie zum Schutz vor dem Einfluss von hyperosmotischen Bedingungen in der Umgebung. Ectoin und sein Derivat 5-Hydroxyectoin sind prominente Mitglieder dieser Stressprotektiva. Aufgrund ihrer Eigenschaften werden Ectoin und 5-Hydroxyectoin auch als „chemische Chaperone“ bezeichnet und finden unter anderem in der pharmazeutischen Industrie Anwendung. Die Ectoin-Biosynthese besteht aus drei Enzymreaktionen und durch eine vierte kann 5-Hydroxyectoin erhalten werden. Die vorliegende Arbeit beschreibt die biochemische und strukturelle Analyse der L-2,4-Diaminobutyrat-Transaminase EctB und der L-2,4-Diaminobutyrat-Acetyltransferase EctA, die die erste Reaktion bzw. die zweite Reaktion der Ectoin-Biosynthese katalysieren. EctB katalysiert die Entstehung von Diaminobutyrat (DAB) und 2-Oxoglutarat aus L-Aspartat-beta-Semialdehyd und L-Glutamat, EctA den anschließenden Acetyltransfer von Acetyl-CoA auf DAB, wobei N-gamma-Acetyl-Diaminobutyrat (N-gamma-ADABA) entsteht. Hierfür wurden Homologe aus dem thermotoleranten Bakterium Paenibacillus lautus genutzt. In diesem Organismus sind die Ectoin-Synthesegene in ungewöhnlicher Kombination mit Genen eines ABC-Transporters,welcher als Ectoin- / 5-Hydroxyectoin spezifischer Ehu-Typ-Transporter identifiziert wurde, organisiert. Diese Komposition ermöglicht die Ressourcen-schonende Regelung des Ectoin-Haushaltes. Die Transaminase (Pl)EctB erweist sich sehr tolerant gegenüber Schwankungen in pH-Wert, Temperatur und Salz-Gehalt. Die durch das tetramere EctB-Protein katalysierte PLP-abhängige Enzymreaktion ist reversibel, wobei die Rückwärtsreaktion eine hohe Verwandtschaft zur gamma-Aminobutyrat-Transaminase (GABA-TA) -Reaktion aufweist. Durch eine in silico Modelling-Studie konnte ebenfalls eine hohe strukturelle Verwandtschaft dieser beiden Enzyme nachgewiesen werden, die auch durch die Fähigkeit von (Pl)EctB, die GABA-TA-Reaktion zu katalysieren, bestätigt wird. Die Acetyl-Transferase (Pl)EctA katalysiert die hoch-regioselektive Bildung von N-gamma-ADABA; das Isomer N-alpha-ADABA, ein Intermediat des Ectoin-Katabolismus, wird nicht gebildet. Die fünf hoch-aufgelösten Kristallstrukturen von (Pl)EctA waren die Basis für die Analyse des reaktiven Zentrums des Enzyms. Mithilfe einer zusätzlichen gerichteten Mutagenese-Studie konnten die an der DAB-Bindung beteiligten Aminosäuren identifiziert werden. Sowohl EctB-Typ-, als auch EctA-Typ-Proteine sind hochkonserviert; die in dieser Arbeit gewonnen Erkenntnisse eignen sich daher als „Blueprint“ für andere Vertreter dieser Enzyme. Einige Organismen besitzen ectC*-Gene, die unabhängig vom klassischen ect-Gencluster auftreten. Die codierten EctC*-Typ-Proteine haben eine starke, strukturelle Ähnlichkeit mit EctC-Typ-Proteinen, die die Eisen-abhängige Reaktion von N-gamma-ADABA zu Ectoin katalysieren. Die katalytische Aktivität der EctC*-Typ-Proteine ist jedoch rudimentär, was darauf hindeutet, dass diese Reaktion nicht die Hauptaufgabe dieser Enzyme ist. Zusammenfassend liefert diese Arbeit, neben einer ersten Analyse der EctC*-Typ-Proteine, detaillierte Informationen über die Biochemie und Struktur der Ectoin-Syntheseenzyme EctA und EctB und vervollständigt damit die strukturelle und biochemische Aufklärung des gesamten Ectoin- / 5-Hydroxyectoin-Biosynthese-Pathways.
Physical Description:146 Pages
DOI:https://doi.org/10.17192/z2020.0094