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Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen der Biosynthese und Metabolisierung von cyclischen Dipeptiden in Actinobacteria
2,5-Diketopiperazine sind die Grundgerüste von einigen bereits zugelassenen Arzneistoffen mit unterschiedlichen Indikationen und stellen ebenso wichtige Grundstrukturen für weitere potentielle Wirkstoffe dar. Das Grundgerüst der 2,5-Diketopiperazine kann unter anderem von Cyclodipeptid-synthasen (CD...
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| Формат: | Dissertation |
| Язык: | немецкий |
| Опубликовано: |
Philipps-Universität Marburg
2019
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| Предметы: | |
| Online-ссылка: | PDF-полный текст |
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| Итог: | 2,5-Diketopiperazine sind die Grundgerüste von einigen bereits zugelassenen Arzneistoffen mit unterschiedlichen Indikationen und stellen ebenso wichtige Grundstrukturen für weitere potentielle Wirkstoffe dar. Das Grundgerüst der 2,5-Diketopiperazine kann unter anderem von Cyclodipeptid-synthasen (CDPSs) synthetisiert werden. Es wurde bereits berichtet, dass die Motive im aktiven Zentrum dieser Enzyme eine Vorhersage über die potentiell gebildeten cyclischen Dipeptide zulassen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine putative Cyclodipeptidsynthase namens CDPS-Np aus Nocardiopsis prasina analysiert. Nach der Betrachtung der Motive im aktiven Zentrum zufolge waren hierbei phenylalanin-haltige cyclische Dipeptide zu erwarten. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass CDPS-Np mit cyclo(L-Tyr-L-Phe) als Hauptprodukt und cyclo(L-Tyr-L-Tyr), cyclo(L-Tyr-L-Met) und
cyclo(L-Tyr-L-Leu) oder cyclo(L-Tyr-L-Ile) als Nebenprodukte tyrosin-haltige cyclische Dipeptide synthetisiert. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass diese Vorhersagen zwar einen Hinweis auf die Synthese cyclischer Dipeptide ermöglichen, der experimentelle Nachweis der tatsächlichen Produkte jedoch unverzichtbar ist. Aufgrund der Abweichung der tatsächlichen von der erwarteten Produktbildung von CDPS-Np wurden die Motive im aktiven Zentrum genauer betrachtet. Durch zielgerichtete Mutagenese innerhalb der zwei Bindetaschen P1 und P2 des aktiven Zentrums von
CDPS-Np solllte deren Substratspezifität verändert werden. Hierfür wurden zunächst verschiedene zielgerichtete Mutationen innerhalb der Bindetasche P1 in den Positionen Thr82 und Tyr196 eingeführt. Die ursprüngliche Absicht die Substratspezitität von CDPS-Np zu verändern konnte durch diese Experimente jedoch nicht erzielt werden. Allerdings konnte bei CDPS-Np_T82V_Y196F im Vergleich zum Wildtypen die 8- bzw. 10-fache Produktion von cyclo(L-Tyr-L-Phe) bzw. cyclo(L-Tyr-L-Tyr) festgestellt werden. Gezielt eingeführte Mutationen innerhalb der Bindetasch P2 von CDPS-Np führten ebenso nicht zur Änderung des Produktspektrums.
Während die Cyclodipeptidsynthasen die Grundstruktur für potentielle Wirkstoffe bilden, können diese durch unterschiedliche Enzyme derivatisiert werden. Hierbei können zum einen Methyltransferasen Methyl-Reste auf C- oder O-Atomen anfügen. Zum anderen können Cytochrom P450 Enzyme C-C-Bindungen, Hydroxygruppen oder Doppelbindungen einfügen. In dieser Arbeit wurden Cyclodipeptidoxidasen (CDOs), welche Doppelbindungen an Positionen 3 und 6 in
2,5-Diketopiperazin-Grundgerüste einfügen können, analysiert. Cyclodipeptidoxidasen bestehen aus zwei Untereinheiten, welche nur zusammen zu der enzymatischen Bildung einer Doppelbindung führen. Bisher wurden zwei Cyclodipeptidoxidasen genauer analysiert. Zum einen AlbA und AlbB aus Streptomyces noursei und zum anderen Ndas_1146 und Ndas_1147 aus Nocardiopsis dassonvillei. In dieser Arbeit wurde eine weitere putative Cyclodipeptidoxidase, CDOA-Np und CDOB-Np aus Nocardiopsis prasina, genauer betrachtet. Hierfür wurde die überlappende Gensequenz in einen Vektor zur Überproduktion von CDOA-Np und CDOB-Np in E. coli kloniert. Durch die Identifizierung der enzymatischen Produkte einer Biotransformation des naturlichen Substrats cyclo(L-Tyr-L-Phe) in E. coli konnte die Aktivität von CDOA-Np und CDOB-Np bestätigt werden. Des Weiteren konnte ebenso die Aktivität von His6-CDOA-Np und CDOB-Np-His6 gezeigt werden. Für weitere Untersuchungen wurden die einzelnen Gensequenzen der Cyclodipeptidoxidasen aus Nocardiopsis prasina und Nocardiopsis dassonvillei in verschiedene Expressionsvektoren für E. coli kloniert. Hierbei bedarf es der Optimierung der Überproduktion und Reinigung von CDOA-Np-His6, CDOB-Np-His6, Ndas-1146-His6 und
Ndas-1147-His6. Des Weiteren sollte die Cyclodipeptidoxidase aus Nocardiopsis prasina mit den bereits bekannten Cyclodipeptidoxidasen aus Nocardiopsis dassonvillei und Streptomyces noursei verglichen werden. Hierfür wurde zunächst die überlappende Gensequenz aus Streptomyces noursei zur Überproduktion von AlbA und AlbB in E. coli kloniert. Anschließend wurde die Biotransformation verschiedener cyclischer Dipeptide durch CDOA-Np/CDOB-Np, Ndas_1146/Ndas_1147 sowie AlbA/AlbB untersucht. Nach der Identifizierung der enzymatischen Produktbildung durch die drei Cyclodipeptidoxidasen mittels LC-MS wurden diese miteinander verglichen, was bisher noch nicht betrachtet wurde. Die Ergebnisse zeigen, dass diese sich sehr ähnlich, jedoch nicht gleich verhalten.
Der Reaktionsmechanismus der CDOs ist weitgehend unbekannt. Es kommt hierbei eine direkte Dehydrierung, eine α-Hydroxylierung mit anschließender Dehydratation oder eine Imin-Bildung in Verbindung mit einer anschließenden Isomerisierung in Frage. In dieser Arbeit wurde der Reaktionsmechanismus anhand einer Biotransformation von deuteriertem cyclo(L-Tyr-L-Phe) durch CDOA-Np/CDOB-Np aus Nocardiopsis prasina, Ndas_1146/Ndas_1147 aus Nocardiopsis dassonvillei und AlbA/AlbB aus Streptomyces noursei in E. coli analysiert. Nach der Identifizierung der enzymatischen Produkte mittels LC-MS konnten keine Produkte, welche auf Bildung einer Imin-Zwischenstufe hindeuten, festgestellt werden. Diese Ergebnisse deuten somit auf eine direkte Dehydrierung. |
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| Объем: | 189 Seiten |
| DOI: | 10.17192/z2019.0507 |