Inverse PPARβ/δ Agonisten: Rekrutierung von Co-Repressoren und Mechanismen der transkriptionellen Repression

Der Peroxisomen-Proliferator-aktivierte Rezeptor β/δ (PPARβ/δ) bindet als Klasse II Kernrezeptor mit seinem obligatorischen Heterodimerisierungspartner RXR an PPAR-responsive Elemente (PPREs) der DNA. Im unligierten Zustand übt PPARβ/δ durch die Rekrutierung von NCoR/SMRT-Komplexen eine basale Repre...

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Main Author: Legrand, Nathalie
Contributors: Adhikary, Till (PD Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2019
Subjects:
ini
Ini
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:Der Peroxisomen-Proliferator-aktivierte Rezeptor β/δ (PPARβ/δ) bindet als Klasse II Kernrezeptor mit seinem obligatorischen Heterodimerisierungspartner RXR an PPAR-responsive Elemente (PPREs) der DNA. Im unligierten Zustand übt PPARβ/δ durch die Rekrutierung von NCoR/SMRT-Komplexen eine basale Repression auf die Transkription seiner kanonischen Zielgene aus. Die Bindung eines Agonisten führt zur Dissoziation dieser Co-Repressoren und ermöglicht die Rekrutierung von Co-Aktivatoren, was letztlich in einer Aktivierung der Transkription resultiert. Synthetische inverse Agonisten bewirken hingegen eine verstärkte Repression, die eine Aktivierung der Transkription des Zielgens ANGPTL4 durch verschiedene Stimuli auf dominante Weise unterdrückt. Die TGFβ-vermittelte Induktion der ANGPTL4-Transkription ist ein zentraler fördernder Schritt im Metastasierungsprozess von Brustkrebszellen. Aufgrund ihrer Eigenschaften, diese transkriptionelle Aktivierung von ANGPTL4 dominant zu unterbinden, sind inverse PPARβ/δ Agonisten vielsprechende Kandidaten in der Wirkstoffentwicklung zur Behandlung von Neoplasien. Der zugrundeliegende Mechanismus war weitgehend unverstanden, und Experimente unserer Arbeitsgruppe wiesen zunächst darauf hin, dass der dominant-repressive Effekt nicht durch NCoR/SMRT-Komplexe und die Deacetylase-Aktivität ihrer HDAC3-Untereinheit vermittelt wird. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Aufklärung des Mechanismus der transkriptionellen Repression durch inverse PPARβ/δ Agonisten. Dabei diente das besonders stark durch PPARβ/δ Liganden regulierte Zielgen ANGPTL4 als Modell-Locus. In ChIP-qPCR Experimenten konnte gezeigt werden, dass der inverse PPARβ/δ Agonist PT-S264 den Ablauf der Transkription von PPARβ/δ Zielgenen am Schritt der Initiation bzw. Reinitiation beeinträchtigt. Es wurde eine verminderte Rekrutierung aktivierender Untereinheiten des Mediator-Komplexes (MED1, MED26 und MED13L) sowie des generellen Transkriptionsfaktors (GTF) TFIIB und der RNA-Polymerase II zum ANGPTL4 Promotor festgestellt. Die Rekrutierung anderer GTFs wie TFIIA wird hingegen nicht beeinflusst. Aus der Literatur ist bekannt, dass der Mediator-Komplex die Rekrutierung von TFIIB unterstützt und dass sowohl der Mediator-Komplex als auch TFIIB für die Rekrutierung der RNA-Polymerase II zum Präinitiationskomplex erforderlich sind. Somit könnte letztlich die beeinträchtige Rekrutierung von aktivierenden Mediator-Untereinheiten (oder des gesamten Mediator-Komplexes) für die Beeinträchtigung der Rekrutierung von TFIIB und der RNA-Polymerase II ursächlich sein. Zur Identifikation von Co-Repressoren, die in Anwesenheit eines inversen Agonisten von PPARβ/δ rekrutiert werden, wurden ChIP-massenspektrometrische Analysen durchgeführt. Komponenten der NCoR/SMRT-Komplexe wurden als spezifische Interaktoren bei Bindung des inversen Agonisten PT-S264 detektiert. Unter den PT-S264 abhängigen Interaktoren fanden sich darüber hinaus keine anderen bekannten Co-Repressoren. Die verstärkte Rekrutierung von NCoR/SMRT-Komplexkomponenten durch PPARβ/δ bei Bindung des inversen Agonisten konnte in ChIP-qPCR Experimenten bestätigt werden. Um weitere Erkenntnisse über die transkriptionelle Regulation durch PPARβ/δ und insbesondere die Bindung der in Anwesenheit von PT-S264 rekrutierten Co-Repressoren zu gewinnen, wurde ein funktioneller Screen von 80 PPARβ/δ-Mutanten durchgeführt. MDA-MB-231-luc2 PPARD KO Zellen wurden retroviral mit mutierten PPARD cDNAs transduziert und auf eine Beeinträchtigung der transkriptionellen Regulation des Zielgens ANGPTL4 untersucht. Dabei wurden, neben der verstärkten Repression durch den inversen PPARβ/δ Agonisten PT-S264, auch die basale Repression und die Aktivierung durch den PPARβ/δ Agonisten L165,041 betrachtet. Mehrere in diesem funktionellen Screen identifizierte Mutanten zeigten einen Verlust der basalen Repression und waren von besonderem Wert für die weitere Untersuchung des Mechanismus der Repression durch inverse PPARβ/δ Agonisten. So zeigte sich im Basalzustand gegenüber den mit Wildtyp PPARβ/δ rekonstituierten Zellen eine verminderte Anwesenheit von NCoR/SMRT-Komplexkomponenten an PPREs von PPARβ/δ Zielgenen, die mit einer vermehrten Rekrutierung der RNA-Polymerase II an die Promotoren einherging. Durch den inversen Agonisten PT-S264 konnte die Rekrutierung von NCoR/SMRT-Komplexkomponenten und die daraus resultierende verminderte Rekrutierung der RNA-Polymerase II zum Promotor in den Mutanten wiederhergestellt werden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass sowohl die basale Repression als auch die Repression durch inverse PPARβ/δ Agonisten von NCoR/SMRT-Komplexen vermittelt werden. Die Rolle der enzymatischen Untereinheit der NCoR/SMRT-Komplexe HDAC3 bei der Repression wurde durch den Einsatz von Deacetylase-Inhibitoren überprüft. Dabei verhielten sich die basale Repression und die Repression durch den inversen Agonisten größtenteils insensitiv gegenüber der Inhibition von Deacteylase-Aktivität. Somit deuten die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit darauf hin, dass NCoR/SMRT-Komplexe die transkriptionelle Repression durch inverse PPARβ/δ Agonisten über Deacetylase-abhängige und Deacetylase-unabhängige Mechanismen vermitteln. Die Unterdrückung der Rekrutierung von aktivierenden Mediator-Untereinheiten ist wahrscheinlich ursächlich für das Ausbleiben der Rekrutierung von TFIIB und der RNA-Polymerase II zum Transkriptionsstart. Somit wird letztlich die Transkription am Schritt der Initiation bzw. Reinitiation gestört. Abschließend wurden zwei Hypothesen aufgestellt, die interessante Fragestellungen für zukünftige Projekte aufwerfen: I. NCoR bzw. SMRT verhindern die Bildung eines aktiven Initiationskomplexes durch die direkte Inhibition von Acetyltransferase-Aktivität oder durch andere deacetylase-unabhängige Mechanismen. II. NCoR bzw. SMRT verhindern Kontakte zwischen regulatorischen Elementen und dem Promotor durch die Regulation von Chromatin-Interaktionen. Angesichts der Stabilisierung von Cohesin-Komplexen durch Acetylierungen könnte dies in direktem Zusammenhang mit Hypothese I stehen.
Physical Description:238 Pages
DOI:https://doi.org/10.17192/z2019.0422