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Entwicklung eines Westernblot-Testsystems zur Detektion der humanen Transkriptionsfaktoren GATA-3 und T-Bet
Asthma bronchiale ist eine chronische entzündliche Erkrankung der Atemwege. Das betroffene Patientenkollektiv lässt sich anhand unterschiedlicher Kriterien in verschiedene Phänotypen und Endoypen einteilen. Biomarker sind Grundlage für die Stratifikation der betroffenen Patienten und auch immer m...
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| Main Author: | |
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| Contributors: | |
| Format: | Doctoral Thesis |
| Language: | German |
| Published: |
Philipps-Universität Marburg
2018
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| Subjects: | |
| Online Access: | PDF Full Text |
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| Summary: | Asthma bronchiale ist eine chronische entzündliche Erkrankung der Atemwege.
Das betroffene Patientenkollektiv lässt sich anhand unterschiedlicher Kriterien in
verschiedene Phänotypen und Endoypen einteilen. Biomarker sind Grundlage für
die Stratifikation der betroffenen Patienten und auch immer mehr
Entscheidungsgrundlage für die zunehmende Personalisierung der Therapie.
In der vorliegenden Arbeit wurde im Rahmen eines Kooperationsprojektes
zwischen dem Institut für Laboratoriumsmedizin und Pathobiochemie -
Molekulare Diagnostik der Philipps-Universität Marburg und der DRG
Instruments GmbH ein primär auf monoklonalen Maus-Antikörpern basierendes
Westernblot-Nachweissystem für die humanen Transkriptionsfaktoren GATA-3
und T-Bet in humanem Vollblut entwickelt.
Ein schon innerhalb der Arbeitsgruppe etabliertes Nachweissystem für GATA-3
und T-Bet in Gesamtprotein aus Zelltypen mit polyklonalen Antikörpern wurde in
dieser Arbeit erfolgreich auf neue Probenmaterialien übertragen. Mit diesen
Antiköpern gelang sowohl der direkte Nachweis der rekombinanten Proteine
(GATA-3 und T-Bet) als auch der Nachweis der Transkriptionsfaktoren in
humanem Vollblut.
Mit den speziell für dieses Projekt entwickelten monoklonalen Maus-Antikörpern
gelang ebenfalls der Nachweis von GATA-3 und T-Bet sowohl für die
rekombinanten Proteine als auch native Proteine in humanen Vollblutproben
mittels Westernblot-Nachweissystem.
Sowohl mit polyklonalen als auch mit monoklonalen Antikörpern konnten
Konzentrationsunterschiede entsprechend der eingesetzten Menge an Probe
und auch artifizielle Konzentrationsunterschiede in mit rekombinantem Protein
gespiketen Blutproben nachgewiesen werden.
Eine unspezifische Signalamplifikation durch den 2. Antikörper konnte durch die
Umstellung auf einen alternativen 2. Antikörper, die Reduktion der verwendeten
Probenvolumina und die direkte Konjugation der monoklonalen Maus-Antiköper
mit HRP vermieden werden.
Im Rahmen der Sensitivitäs- und Spezifitäsprüfung der monoklonalen Maus-
Antiköper zeigten sich Defizite für die α-GATA-3-Antikörper. Rekombinantes
Protein eines anderen Herstellers konnte nicht detektiert werden und es zeigte
sich eine Kreuzreaktivität zwischen rekombinantem Protein T-Bet und
α-GATA-3-Antikörper. Durch höhere Verdünnung des Antikörpers ließ sich die
Kreuzreaktivität vermeiden.
Weiterführende Möglichkeiten zur Testoptimierung bezüglich der verwendeten
Materialien und der Probenaufarbeitung werden im Anschluss diskutiert, ebenso
wie die Einordnung des Testverfahrens in die aktuelle medizinische Forschung
im Kontext der Personalisierung der Diagnostik und Therapie von Asthma
bronchiale. |
|---|---|
| Physical Description: | 109 Pages |
| DOI: | 10.17192/z2018.0342 |