Control of reactive intermediates in enzymes and enzyme complexes

Enzyme sind die Katalysatoren des Lebens. Sie beschleunigen die Rate chemischer Reaktionen, welche unkatalysiert länger als die Lebensspanne eines Organismus dauern würden. Enzyme erreichen diese beeindruckende Beschleunigung indem sie den Überganszustand besser als Substrat und Produkt binden, wodurch sie die Aktivierungsenergie der Gesamtreaktion senken. Zusätzlich sind Enzyme äußerst spezifisch und katalysieren normalerweise exakt eine chemische Reaktion, ohne dabei Seitenprodukte zu produzieren. All dies erreichen sie bei moderaten Temperaturen und innerhalb von Zellen, welche über 2700 unterschiedliche Metabolite enthalten. In dieser Arbeit untersuchen wir die Mechanismen, welche Enzyme nutzen um reaktive Zwischenprodukte zu kontrollieren und damit die Bildung von schädlichen Seitenprodukten verhindern. Im ersten Teil betrachten wir den katalytischen Zyklus von NAD(P)H abhängigen Oxidoreduktasen im Detail. Wir zeigen, dass beide untersuchten Enoylthioesterreduktasen, Etr1p aus Candida tropicalis und der MDR Enyzmsuperfamilie und InhA aus Mycobacterium tuberculosis und der SDR Enzymsuperfamilie, ein kovalentes Zwischenprodukt zwischen dem Substrat und NAD(P)H bilden. Die Beobachtung, dass Enyzme aus beiden Superfamilien ein solches Zwischenprodukt herstellen, stellt nicht nur den herkömmlichen Reaktionsmechanismus in Frage, sondern setzt auch die Grundlage für die Entwicklung von neuen Methoden zur Manipulierung, Erforschung und Inhibierung solcher Oxidoreduktasen. Wir demonstrieren dies mit dem erfolgreichen Umbau der Protonierungsspezifität in Etr1p von der re- zur si-Seite. Zusätzlich nutzen wir das kovalente Zwischenprodukt um aufzuzeigen, dass ein konserviertes Threonin im aktiven Zentrum von Etr1p hauptsächlich dazu dient, die Bildung eines toxischen Seitenproduktes zu verhindern und nicht um den gewünschten Übergangszustand zu stabilisieren. Threonin destabilisiert stattdessen den Übergangszustand zum ungewünschten Seitenprodukt. Dieser Effekt der Destabilisierung wird oft ´negative Katalyse´ genannt und ergänzt die kanonische Theorie des Übergangszustandes. Die Auswirkungen dieses Effektes auf unser Verständnis der Enzymkatalyse werden in dieser Arbeit im Detail diskutiert. Im zweiten Teil dieser Arbeit untersuchen wir zwei Enzymkaskaden und deren Mechanismen, welche den Transfer reaktiver Zwischenprodukte von einem aktiven Zentrum ans nächste ermöglichen. Die trifunktionelle Propionyl-CoA Synthase bildet eine geschlossene Reaktionskammer, um das reaktive Zwischenprodukt Acrylyl-CoA daran zu hindern ins Zytoplasma zu entweichen. Diese Reaktionskammer enthält alle drei aktiven Zentren des Fusionsproteins und ermöglicht dadurch Katalyse der gesamten Enyzmkaskade innerhalb der Kammer. Sie unterscheidet sich dabei jedoch von zielgerichteten Tunneln und anderen herkömmlichen Kanalisierungsmechanismen. Der Thiolase/HMG-CoA-Synthasekomplex von Archaeen kanalisiert das Zwischenprodukt Acetoacetyl-CoA, ähnlich wie Polyketid- und Fettsäurensynthasen, indem er die Pantothenylkomponente von CoA als Arm verwendet, um das Zwischenprodukt von einem aktiven Zentrum ans nächste weiterzureichen. Im Unterscheid zu anderen Systemen ist der Panthothenylarm hierbei jedoch nicht kovalent gebunden, sondern Teil des CoA-Esters, weshalb der Enzymkomplex eine geteilte CoA-Bindetasche besitzt. Die beiden hier beschriebenen Mechanismen stellen daher zwei neue Strategien dar, um mehrere Reaktionen nicht kovalent gebundener CoA-Ester zu kanalisieren.