Genomic Analysis of Secondary Metabolism in U. maydis

Zusammenfassung Obwohl Ustilago maydis ein gut etablierter Modellorganismus zur Erforschung von Interaktionen zwischen Pflanzen und Mikroben ist, ist sein biosynthetisches Potenzial nur unvollständig untersucht. Deshalb wurde in dieser Arbeit das Hauptaugenmerk auf die Identifizierung potenzieller Sekundärmetabolit (SM)-Gencluster im Genom gelegt. Die Kombination von verschiedenen Strategien, wie manuelle Annotation und bioinformatische Ansätze, erlaubte die Identifzierung von 4 potentiellen SM Genclustern (A-D). Die Auswahl von Cluster A für die weiteren Untersuchungen in dieser Arbeit beruhte auf seiner chromosomalen Lokalisation und der Analyse von Genexpressionsprofilen der Clustergene. Zur Analyse der Genexpression in U. maydis wurden alle verfügbaren Daten der öffentlich zugänglichen Datenbank „Gene Expression Omnibus“ in einer Excel-Tabelle zusammengefügt und normalisiert. Die Überexpression des TransKriptionsfaktors Mtf1 in Cluster A führte zu einer Aktivierung von mindestens 12 Genen, unter denen sich auch drei Polyketidsynthasen (pks3, pks4 und pks5), ein Cytochrom P450 (cyp4) und eine Versicolorin B-Synthase (vbs1) waren. Längere Induktion von Cluster A führte zur Produktion eines schwarz-grünen Pigments, das hauptsächlich aus 1,3,6,8-Tetrahydroxynaphthalin (T4HN) besteht. Daher wurde Cluster A Melanin-ähnlicher Cluster genannt. Dieses Ergebnis zeigte bereits, dass U. maydis Melanin über einen ungewöhnlichen Weg synthetisiert, da die meisten pilzlichen Melanine auf DHN, dessen Vorstufe T4HN ist, basieren. Mutanten mit fehlenden pks3, pks4, pks5 und cyp4-Genen zeigten keine Melaninanreicherung, was auf eine essentielle Funktion dieser Gene bei den ersten Schritten der Biosynthese hindeutet. Die Deletion von cyp4 führte zur Produktion von Orsellinsäure (OA) und zwei ihrer Derivate. Interessanterweise konnte durch Zugabe von zum Medium OA der Melanisierungsdefekt der pks3/pks4-Deletionsmutante ausgeglichen werden. Außerdem resultierte die simultane Überexpression der pks3 und pks4-Gene in der Produktion von OA, was darauf hindeutet, dass beide Gene an der OA-Synthese beteiligt sind. OA stellt daher ein wichtiges Zwischen produkt dar, das in nachfolgenden Reaktionsschritten als Substrat für weitere Umwandlungen zu T4HN verwendet wird. Diese Reaktionen werden vermutlich von Cpy4 und/oder Pks5 katalysiert. Überexpression von pks1, einer weiteren Polyketidsynthase-Gen in U. maydis, für das in früheren Arbeiten zusammen mit pks2 und lac1 eine Rolle bei der Melanisierung der Sporen beschrieben wurde, konnte den Phänotyp des Stammes MB215 pks3 Pcrg::mtf1 ausgleichen. Dies deutet darauf hin, dass Pks3 und Pks1 eine vergleichbare biochemische Funktion ausüben. Maiskeimlinge, die mit Stämmen mit Einzelgendeletionen des Melanin-ähnlichen Clusters infiziert wurden, zeigten keinen Effekt auf die Sporenfarbe und hatten nur einen geringen Einfluss auf die Virulenz. Dies unterstützt das vorherige Ergebnis, wonach pks1 und pks2 hauptsächlich zur Melanisierung während der Sporenbildung beitragen. Da die Deletionsmutanten SG200 pks3, SG200 pks4 und SG200 pks5 bei Wachstum auf Wasserstoffperoxid keine signifikanten Unterschiede zum Wildtyp (SG200) aufwiesen, deutet dies darauf hin, dass die Bildung dieses Melanin-ähnlichen Farbstoffs vermutlich eine Rolle bei anderen Stressantworten spielen könnte. Daher sind weitere Experimente nötig, um Bedingungen zu finden, bei denen die Gene dieses Clusters exprimiert sind.