DNA translocases and origin region segregation in B. subtilis

Die Segregation von Chromosomen wird durch spezielle Mechanismen sicher gestellt, welche die Position des Septums sowie die korrekte Trennung von chromosomalen Dimeren gewährleisten und somit an der Aufrechterhaltung der Integrität der chromosomalen DNA während des gesamten Zellzyklus beteiligt sind. Anhand des Gram-positiven Modellorganismus Bacillus subtilis wurden im ersten Teil dieser Arbeit DNA-Translokasen untersucht, welche über einen direkten Transport die Chromosomen von der zellulären Teilungsebene weg bewegen. Bei SpoIIIE handelt es sich um eine Membranintegrierte Translokase, die während der Sporulation aktiv ist. Es wurde bereits gezeigt, dass SftA hingegen in vitro löslich ist und über einen bisher unbekannten Mechanismus mit dem Divisionsseptum assoziiert. Die Löslichkeit von SftA in vivo wurde über Zell-FraktionierungsExperimente nachgewiesen. Der Teil des Proteins, welcher zur Bindung an das Septum führt, wurde über die Lokalisation von unterschiedlichen, trunkierten und fluoreszenzmarkierten SftA Derivaten identifiziert, wodurch die für die Bindung an das Septum verantwortlichen Aminosäuren eingegrenzt werden konnten (siehe Manuskript, 4A). Über die Expression in einem eukaryotischen, heterologen System konnte eine Interaktion von SftA mit FtsA, jedoch nicht mit FtsZ nachgewiesen werden. Ein weiterer Nachweis hierfür wurde über Experimente durch single molecule tracking erbracht, wobei die lösliche Fraktion der SftA-Moleküle bei geringer Expression von FtsA im Vergleich zu dem Wildtyp zunimmt. Untersuchungen auf Einzelmolekül-Level von SpoIIIE, einer Membran-assoziierten DNATranslokase in B. subtilis und PfkA, einer löslichen Phosphofructokinase, ließen auf ein unterschiedliches Verhalten der beiden Translokasen (SftA und SpoIIIE) schließen: SftA besitzt eine am Septum gebundene Fraktion und eine kleine, sich schnell bewegende, lösliche Fraktion, welche mit der ausschließlich löslichen PfkA-Fraktion vergleichbar ist. SpoIIIE ist im Vergleich weniger dynamisch, wobei sogar die dynamische Fraktion viel langsamer ist als die statische SftA Fraktion. Scheinbar bewegt sich SpoIIIE langsam entlang der Membran, ohne sich am Septum anzureichern; selbst nach der Zugabe von Mitomycin C (MMC, siehe Manuskript 4B). Der zweite Teil dieser Arbeit befasste sich mit der Anzahl von Nukleoiden, Origin- und Termini unter schnellen und langsamen Wachstumsbedingungen, mit oder ohne Induktion von Doppelstrangbrüchen durch MMC. B. subtilis scheint vornehmlich diploid zu sein, mit polyploiden und monoploiden Zellfraktionen, welche sich abhängig von den gewählten Wachstumsbedinungen verändern. Die Replikation von benachbarten Regionen der Replikationsursprünge nahm nach der Induktion von DNA-Schäden zu, wie schon durch die Zunahme der Anzahl von Origins während der DNA-Reparatur gezeigt wurde, während die Anzahl der Terminatorsequenzen konstant blieb. Time lapse Experimente der Segregation von markierten Replikationsursprüngen zeigte, dass sich die Bewegung der Moleküle am besten durch gezielte Diffusion beschreiben lässt, welche sich durch die Zugabe von MMC oder Ciprofloxacin, welches die Topoisomerase IV inhibiert, zwar verlangsamt, sich jedoch als robust und kontinuierlich beschreiben lässt