Fragmentscreening an der CDPME-Synthetase (IspD): Neue Leitstrukturen für ein Enzym in der Malaria und Tuberkulose-Therapie
Zusammenfassung Hintergrund In den letzten 20 Jahren wurde der Ansatz des Fragment-Based Drug Design (FBDD) derart weiterentwickelt, dass er heute eine wichtige Rolle in der Suche nach neuen Lead-Verbindungen spielt, was sich in der Zulassung des Arzneimittel Vemurafenib durch die FDA äußerte (201...
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| 1. Verfasser: | |
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| Beteiligte: | |
| Format: | Dissertation |
| Sprache: | Deutsch |
| Veröffentlicht: |
Philipps-Universität Marburg
2015
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| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | PDF-Volltext |
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| Zusammenfassung: | Zusammenfassung
Hintergrund
In den letzten 20 Jahren wurde der Ansatz des Fragment-Based Drug Design (FBDD) derart weiterentwickelt, dass er heute eine wichtige Rolle in der Suche nach neuen Lead-Verbindungen spielt, was sich in der Zulassung des Arzneimittel Vemurafenib durch die FDA äußerte (2011), das über einen Fragment-basierten Ansatz entdeckt wurde. Dieser Erfolg motiviert, die Herausforderungen des FBDD zur Detektion von Fragmenthits anzunehmen. Diese bestehen darin, dass konventionelle Bioassay-basierte Methoden für ein Screening mit in der Regel eher schwach bindenden Fragmenten oft ungeeignet sind. Um mit dem Fragmentscreening zu optimalen Ergebnissen zu gelangen ist jedoch nicht nur die Wahl der Methoden wichtig, sondern auch die Strategie ihrer Anwendung.
Ziele
In dieser Arbeit wurden Strategien zur schnellen und kostengünstigen Identifizierung von Fragmenthits hoher Qualität entwickelt. Die erste Strategie ist eine Fragment-Screening Kaskade, welche ein Screening-, eine Validierungs- und eine Charakterisierungsstufe umfasst, um schnelles, effizientes, X-Ray-unabhängiges Screening zu ermöglichen (besonders für Zielproteine geeignet, die sich nicht kristallisieren lassen). Die zweite Strategie basiert rein auf Kristallographie, um die Hitidentifizierung effizienter zu gestalten. In diesem Rahmen wurden die Arbeitsprozesse der Kristallisation optimiert und neue Methoden zur Kokristallisation und zum Kristallsoaking entwickelt.
Ergebnisse
1. Fragment-Screening-Kaskade: Es wurde eine Screening-Kaskade entwickelt, die in der ersten Stufe mittels TSA und Enzym-Assays der Identifizierung von Primärhits für das Protein IspD dient. Die zweite Stufe umfasst eine Liganden-basierte NMR-Suche (WATERLOGSY) zur Reduktion der Primärhits und deren Validierung durch Unterscheidung von spezifischen und unspezifischen Bindern durch Verdrängungsexperimente. In der dritten Stufe erfolgt die proteinbasierte NMR-Suche (TROSY) zur Charakterisierung der Bindungsmodi durch Vergleich mit Referenzspektren. In der ersten Kaskadenstufe konnten 27 Primärhits erfolgreich identifiziert und in der zweiten Stufe auf zwei Hits reduziert werden, wobei sich für Fragment 134 eine nichtkompetitive Bindung feststellen lies. In der dritten Stufe konnte mittels TROSY-NMR die Bindung des Fragments 005 leider nicht bestätigt werden. Die Experimente zur Screening-Kaskade zeigen, dass sie eine zeitsparende, weniger kostenaufwendige und effizientere Hitidentifizierung ermöglicht. Allerdings muss die Kaskade mit weiteren Modellproteinen getestet werden. Das wenig erfolgreiche Ergebnis der TROSY-NMR ist darauf zurückzuführen, dass die IspD-Bindetasche polar und geladen ist und die Fragmente in der verwendeten Bibliothek nur wenig polar sind und keine hohen Ladungen aufweisen.
2. Fragment Screening ausschließlich mit Kristallographie: Es wurde eine systematische Herangehensweise an die Kristallisation entwickelt, bei der Mikroseeding und Feinjustierung mittels DVR/DV zum Einsatz kommen, um Kristallisationsbedingungen sehr schnell zu optimieren und die Bedingungen für das Arbeiten unter anderen Temperaturen anzupassen. Die so erzeugten IspD-Kristalle waren von sehr hoher Diffraktionsfähigkeit bei guter Reproduzierbarkeit. Außerdem wurde die Baking-Methode entwickelt, welche erstmals ein effizientes Screening mittels Kokristallisation möglich macht, da die Kokristallisationsbedingungen nicht für jedes Fragment individuell optimiert werden müssen. Auch ermöglicht sie die Immobilisierung vollständiger Fragmentbibliotheken in Mikrotiterplatten. Für die Verbesserung des Soakingprozesses wurde zum einen die Isosoak-Methode entwickelt, die ein schnelles Auffinden von Soakingbedingungen erlaubt und auch das Soaking bei sehr hohen Fragmentkonzentrationen ermöglicht. Zum anderen wurde die Unisoak-Methode entwickelt, die Kristallsoaking unter Standardbedingungen bzw. ein Soaking von vielen Kristallen gleichzeitig, möglich macht (erfolgreich getestet an sieben kristallinen Proteinen gleichzeitig). Die Diffraktionsfähigkeit der gesoakten Kristalle gegenüber den Kristallen der Apoproteine ist von mindestens gleicher Qualität. Studien der AG Klebe zeigen, dass verschiedene Screeningmethoden nur wenige sich überlappende Ergebnisse liefern, was einen rein kristallographischen Ansatz wünschenswert macht, der direkt die exakten Bindungsmodi liefert. Die hier entwickelten Methoden geben die dazu nötigen Werkzeuge an die Hand, um ein sehr effektives, zeit- und kostensparendes Arbeiten zu ermöglichen. Besonders im Feld des Soakings sind entscheidende Fortschritte gemacht worden. Auf die für die Dateninterpretation problematischen Coktailscreenings kann nun verzichtet werden, da Fragmente nun schnell individuell gesoakt werden können. Durch die Verbesserungen des Soakingprozesses rückt das Fragmentscreening auch für kleine bis mittelgroße Unternehmen in den Bereich des Möglichen. |
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| Umfang: | 204 Seiten |
| DOI: | 10.17192/z2015.0482 |