Chemische Modifikation von OmpG und VDAC zur Herstellung von Hybridionenkanälen

Membranproteine wie passive Kanäle und Poren, aktive Transporter und Rezeptoren sind essentiell für die Kommunikation zwischen Zellen, als auch für den Fluss von Substanzen über die von der Zellmembran geformten Permeabilitäts-Barrieren. Aufgrund dieser Eigenschaften stehen Memebranproteine als Angr...

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Main Author: Hirsch, Boris
Contributors: Koert, Ulrich (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2015
Subjects:
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:Membranproteine wie passive Kanäle und Poren, aktive Transporter und Rezeptoren sind essentiell für die Kommunikation zwischen Zellen, als auch für den Fluss von Substanzen über die von der Zellmembran geformten Permeabilitäts-Barrieren. Aufgrund dieser Eigenschaften stehen Memebranproteine als Angriffsziel für Wirkstoffe im Interesse der pharmazeutischen Industrie. Durch chemische, sowie biologische Methoden zur Funktionalisierung kann das Verhalten von Ionenkanälen verändert werden, wodurch Einblicke in die Funktionsweise dieser Kanäle gewonnen wird. Diese Informationen können anschließend verwendet werden als Basis zur Gestaltung komplexer Biohybrid-Systemen, sowie um neue Angriffsziele für Wirkstoffe zu detektieren und um komplexere biochemische Kaskaden zu Verstehen. In der vorliegenden Arbeit wurden chemische Modulatoren zur Funktionalisierung der Porine OmpG und VDAC hergestellt. Das integrale Membranprotein OmpG, welches in der äußeren Membran des Gram-negativen Bakteriums Escherichia coli vorkommt, bildet ein β-barrel aus 14 β-Faltblättern mit einem Innendurchmesser von 12 ∙ 15 Å. VDAC kommt vorwiegend in der äußeren Membran von Mitochondrien vor und bildet ein β-barrel aus 19 β-Strängen. Der Innendurchmesser wird durch eine in die Pore reichende α-Helix, welche essentiell für das Schaltverhalten ist, auf 15 ∙ 26 Å begrenzt. Die Modifizierung von OmpG sollte über doppelte S-Alkylierung von Cysteinen im Porenin-nenraum mit Haloacetamiden erfolgen. Hierzu wurden zwei unterschiedliche Herangehens-weisen benutzt: Zum Einen wurden monofunktionalisierte Bipyridin-Linker hergestellt, welche nach Einbringen in die Pore mit Schwermetallen wie Kupfer einen stabilen Komplex bilden sollen, der die Pore blockiert. Zum Anderen wurden Bishaloacetamide mit unterschiedlichen Kernen synthetisiert, welche direkt bei der Reaktion mit OmpG eine Querverstrebung durch die Pore bilden und damit die Leitfähigkeit der Pore reduzieren sollten. Von den hergestellten Bipyridin-Linkern zeigte eine Verbindung erfolgreichen Umsatz mit OmpG und es gelang von diesem Biohybrid eine Röntgenkristallstruktur zu erhalten, welche zwei Bipyridin-Linker kovalent in der Pore gebunden zeigt. ICP-Messungen des Kupferanteils in dem dialysierten Biohybrid zeigten, dass dieser in der Lage ist Kupfer zu binden, dabei allerdings keine vollständige Sättigung erreicht wurde. BLM-Messungen zur Bestimmung der Leitfähigkeit zeigten hingegen keine Änderung nach Zugabe von Kupfer(II)sulfat. Bei den Bishaloacetamiden wurde der Fokus auf Terphenyl- und Azakronenether-Rückräder gelegt. Es gelang Bishaloacetamide von einem ein wasserlöslichen Terphenyl, sowie von einer Azakrone mit Glycinspacern herzustellen und mit OmpG umzusetzen. Beide Umsetzungen zeigten uneindeutige Ergebnisse bezüglich der Querverknüpfung, allerdings gelang es Proteinkristall zu erhalten, welche allerdings nicht prozessiert werden konnten. Zur Modifikation einer VDAC-Deletionsmutante sollte ein chemisch modifiziertes Peptid über native chemical ligation (NCL) in VDAC eingebracht werden. Ein entsprechender Peptidthioester aus zehn Aminosäuren wurde mittels SPPS sowie mittels Fragmentsynthese hergestellt. Nur die Fragmentsynthese erbrachte das gewünschte C-Terminal entschützte Peptid in hoher Reinheit. Reaktionen, um dieses Peptid in den benötigten Ethylthioester für die NCL zu überführen, führten zu einer Mischung aus Ethylthio- und Methylester, welche nicht getrennt werden konnte. Es konnte kein sauberer Thioester für die NCL hergestellt werden.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2015.0351