An extracellular drug binding site of potassium channels THIK-1 and THIK-2

Hintergrund: THIK-1, THIK-2 und TREK-1 gehören zur Familie der Zwei-poren-domänen Kaliumkanäle (K2P Kanäle). THIK-2 wurde bis vor kurzem als inaktiver Kaliumkanal angesehen. 3-isobutyl-1-methylxanthin (IBMX) wird normalerweise als Phosphordiesterasehemmer verwendet, der die intrazelluläre c-AMP Konzentration erhöht. Ziel der Arbeit: Identifizierung einer extrazellulären Bindungsstelle am THIK-1 und THIK-2. Methoden: Ganzzellstrommessungen an Säugetierzellen wurden durchgeführt um die obigen K2P Kanäle zu untersuchen. Chemikalien wie IBMX, Forskolin und c-AMP wurden intrazellulär über die Pipette und/oder extrazellulär über die Badlösung zugegeben. Um die IBMX Bindungsstelle am THIK-1 zu finden wurden alle Aminosäuren der äußeren Helices einzeln ausgetauscht und die Stärke des IBMX Blocks ermittelt. Um die Oberflächenexpression des Kanals zu bestimmen, wurde ein HA-markierter THIK-2 Kanal verwendet und mittels eines antikörperbasierten Verfahrens dessen Oberfächenkonzentration quantifiziert. Ergebnisse: Wir haben gemessen, dass 1 mM IBMX die Einwärts- und Auswärtsströme von THIK-1 sehr schnell blockiert. Die Zugabe von H89, einem PKA-Inhibitor, und von Forskolin, einem PKA-Aktivator veränderte den Effekt von IBMX auf den Kanal nicht. Die intrazelluläre Zugabe von 100 μM c-AMP blockierte den TREK-1 Strom fast vollständig, beeinflusste jedoch nicht den THIK-1 Strom, woraus man schließen kann, dass IBMX nicht über eine Erhöhung der c-AMP Konzentration auf den THIK-1 wirkt. Außerdem beobachteten wir, dass IBMX die THIK-1 Ströme nur blockiert, wenn es von der extrazellulären Seite zugegeben wird. Eine Mutationen in der extrazellulären Region von THIK-1 and Position 92 (THIK-1R92A) bewirkte eine Abnahme der Affinität der Binding von IBMX an den Kanal. Eine Mutation dieser Aminosäure (R92) zu Glutamin oder Glutaminsäure verringerte die Affinität noch stärker. R92 liegt in der Verbindungsschleife zwischen der Helix 2 und der Porenhelix des Kanals. IV Diese Region ist teilweise nicht in der Kristallstruktur sichtbar; R92 liegt am Ende dieser unstrukturierten Region. Im Vergleich zum THIK-1 besitzt der THIK-2 einen zusätzliches Segment am N-Terminus (Aminosäure 6 - 24) welches ein potentielles Retentionssignal (RRR) enthält. Durch Herausschneiden dieses Segments (THIK-2Δ6-24) oder Mutation von RRR nach AAA (THIK-2AAA) konnten THIK-2 Mutanten erzeugt werden, die einen messbaren Strom zeigten. Darüber hinaus konnte gezeigt werden dass die Oberflächenexpression eines Reporterproteins (CD74), das mit dem modifizierten N-Terminus von THIK-2AAA fusioniert wurde, mehr als dreimal so hoch war als unter Kontrollbedingungen (Fusion mit dem nicht modifizierten N-Terminus von THIK-2. Daraus läßt sich schließen, dass das ER Retentionssignal RRR den Transport von THIK-2 zur Zellmembran verhindert und zu einem elektrisch inaktiven Kanal führt. Außerdem fanden wir heraus, dass THIK-2 Ströme ebenfalls durch IBMX von der extrazellulären Seite blockiert werden können. Schlußfolgerungen: IBMX blockiert TREK-1 Kanäle über die PKA Phosphorilierung. IBMX bindet auch an der extrazellulären Seite von THIK-1 und THIK-2 und führt zu einem direkten Block. Das ist eine neue bisher nicht beschriebene Wirkung von IBMX auf K2P Kanäle. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, daß der C2-P1 Linker und insbesondere das Arginin an der Stelle 92 beim THIK-1 an der IBMX Bindung beteiligt sind.