Publikationsserver![Heterologe Produktion und Reifung einer löslichen sauerstofftoleranten [NiFe]-Hydrogenase aus Cupriavidus necator in Escherichia coli](/diss/z2013/0755/cover.png)
Heterologe Produktion und Reifung einer löslichen sauerstofftoleranten [NiFe]-Hydrogenase aus Cupriavidus necator in Escherichia coli
Ziel dieser Arbeit war die Produktion und Reifung einer O2-toleranten [NiFe]-Hydrogenase, der SH aus Cupriavidus necator (Cn), in Escherichia coli (Ec). Zu diesem Zweck wurde zunächst ein verfügbares Basis-Klonierungssystem (StarGate®, IBA) erweitert, um den Anforderungen einer Multigen- und Hochaus...
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| 1. Verfasser: | |
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| Beteiligte: | |
| Format: | Dissertation |
| Sprache: | Deutsch |
| Veröffentlicht: |
Philipps-Universität Marburg
2013
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| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | PDF-Volltext |
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| Zusammenfassung: | Ziel dieser Arbeit war die Produktion und Reifung einer O2-toleranten [NiFe]-Hydrogenase, der SH aus Cupriavidus necator (Cn), in Escherichia coli (Ec). Zu diesem Zweck wurde zunächst ein verfügbares Basis-Klonierungssystem (StarGate®, IBA) erweitert, um den Anforderungen einer Multigen- und Hochausbeute-Expressionsplattform für den Modellorganismus Escherichia coli zu entsprechen. Die erste Erweiterung beinhaltete das Design neuer Fusionsvektoren, die jedes Gen unter Kontrolle individueller T7-Promotoren und –Terminatoren stellen und die Verknüpfung jedes Genprodukts mit N- oder C-terminalen StrepII-Tags ermöglichen. Unter Einsatz des neuen Systems wurden insgesamt 21 Hydrogenase-assoziierte Cn-Gene, darunter die fünf SH-Stukturgene sowie zwei vollständige Sätze putativer Reifungsgene, systematisch zu funktionalen Multigen-Einheiten (Modulen) assembliert. Die Koexpression von bis zu 10 Genen innerhalb von SH- oder Reifungsmodulen auf einem Plasmid konnte erfolgreich demonstriert werden. Um eine Kombination der SH-Gene mit den Reifungsmodulen in einer Zelle zu ermöglichen, erfolgte anschließend die Entwicklung kompatibler Akzeptorvektoren. Daraufhin konnten Expressionsstämme mit unterschiedlichen Vektor- und Modul-Kombinationen generiert, und damit sowohl SH-Produktions- als auch kombinatorische Studien zum SH-Reifungsprozess ermöglicht werden.
SH-Produktionsversuche mit rekombinanten Ec-Stämmen deuteten darauf hin, dass die maximale Löslichkeit und Funktionalität der Reifungsproteine nicht nur von der Gendosis und Expressionsrate, sondern auch maßgeblich von einem transienten, wachstumsabhängigen zellulären Milieu abhängig ist. Aus diesem Grund wurde eine spezielle Kultivierungsstrategie zur SH-Produktion erarbeitet, welche auf einem bekannten Laktose-Autoinduktionssystem basiert. Im Zuge umfangreicher Optimierungsstudien wurden aerobe Langzeit-Kultivierungen mit sequentieller Modifikation der physikalischen Wachstumsparameter und der Medienzusammensetzung vorgenommen. Die Strategie wurde auf die rekombinanten Stämme angewendet und ergab eine einheitliche maximale SH-Aktivität innerhalb der mittstationären Phase 36–40 Stunden nach Inokulation. Maximale spezifische Aktivitäten in Extrakten lagen mit 7,2 U•mg-1 in der Größenordnung der Werte, welche bei optimierten Kultivierungen zur Produktion nativer SH in Cn erreicht wurden. Die Kombination der vorgestellten Expressionsplattform mit dem erarbeiteten Kultivierungsprozess stellt somit die erste Hochausbeute-Produktionsplattform für eine rekombinante [NiFe]-Hydrogenase dar.
StrepII-getaggte SH-Varianten konnten homogen aus Zellen rekombinanter Stämme isoliert werden. Mit bis zu 227 U•mg-1 wurde hierbei die höchste bisher für die SH dokumentierte spezifische Aktivität erreicht. In diesen hochreinen Präparationen war die Enzymausbeute verringert, lag jedoch stets im Milligramm-Bereich pro Liter Kultur. Sowohl hinsichtlich der oligomeren Enzymstruktur als auch der katalytischen Eigenschaften entsprachen die rekombinanten Varianten der aus Cn-Zellen isolierten Wildtyp-SH.
Durch Entwicklung der kombinatorischen Expressionsplattform wurden innovative Strategien zur Untersuchung des Reifungsprozesses von [NiFe]-Hydrogenasen ermöglicht. Dies wurde anhand der SH als Modellenzym demonstriert. Einzelne Proteine sowie essentielle Reifungs-Intermediate (Komplexe) zweier unabhängiger Reifungsmodule aus Cn wurden rekombinant produziert und gereinigt. Dies lieferte Hinweise darauf, dass die Stabilität der einzelnen Reifungsproteine in vivo stark von der Ausbildung oligomerer Formen und stöchiometrischer Reifungs-Komplexe abhängt. Durch Reinigung der SH-spezifischen Endopeptidase HoxW konnten darüber hinaus Hinweise auf ein redoxaktives [4Fe-4S]-Cluster mit bislang unbekannten Eigenschaften geliefert werden. In-vivo-Deletions- und Substitutionsstudien mit analogen Reifungsproteinen (Hyp) verschiedener Module aus Cn und Ec lieferten darüber hinaus Erkenntnisse über Spezifitäten und damit die Möglichkeit partieller Komplementation.
Durch Entwicklung eines zellfreien in-vitro-Reifungssystems für die SH konnten die in-vivo-Experimente anschließend entscheidend ergänzt werden. Essentielle Komponenten und limitierende Faktoren des Reifungsprozesses wurden ermittelt. Erste „Pulldown“-Experimente lieferten Hinweise darauf, dass bislang unbekannte Reifungsintermediate durch das in-vitro-System identifiziert werden könnten. Dadurch erweist sich die vorgestellte Methodik als potentes grundlagenorientiertes Werkzeug zur Untersuchung des Reifungsprozesses. |
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| DOI: | 10.17192/z2013.0755 |