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Chondrozytärer Kohlenhydratmetabolismus und Zellvitalität boviner artikulärer Knorpelexplantate in statischer Kultur zur Analyse der Bedeutung von FCS und des nutritiven Potentials von Fructose für Knorpel in vitro
Unter Beleuchtung des chondrozytären Kohlenhydratstoffwechsels und Zellüberlebens in vitro sollten im Rahmen dieser Studie folgende Fragen beantwortet werden: 1. Ist FCS als Nährmediumsupplement zusätzlich zu ITS vorteilhaft? 2. Kann Fructose Glucose im Medium als chondrozytäres Energiesubstrat mi...
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| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Beteiligte: | |
| Format: | Dissertation |
| Sprache: | Deutsch |
| Veröffentlicht: |
Philipps-Universität Marburg
2013
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| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | PDF-Volltext |
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| Zusammenfassung: | Unter Beleuchtung des chondrozytären Kohlenhydratstoffwechsels und Zellüberlebens in vitro sollten im Rahmen dieser Studie folgende Fragen beantwortet werden:
1. Ist FCS als Nährmediumsupplement zusätzlich zu ITS vorteilhaft?
2. Kann Fructose Glucose im Medium als chondrozytäres Energiesubstrat mit Minimierung von Lactatproduktion und pH-Wert-Verschiebung ersetzen?
3. Wie hoch ist der Energiebedarf des kultivierten Knorpels und hat die Höhe des nutritiven Angebots Auswirkungen auf Zellmetabolismus bzw. -vitalität?
Dazu wurden 96 Knorpelchips aus den Schultergelenken eines eineinhalb Jahre alten Rindes 16 Versuchsgruppen zugeordnet und bei 37° C sowie atmosphärischem O2- und CO2-Gehalt unter statischen Bedingungen in Multiwell-Platten inkubiert. Das Nährmedium (DMEM) wurde alle 48 h gewechselt und in 4 Varianten eingesetzt: M1A - 1 g/L Fructose; M1B - 1 g/L Fruct, 2% (V/V) FCS; M2A - 1 g/L Glucose; M2B - 1 g/L Gluc, 2 % (V/V) FCS. Alle enthielten 2 mM Glutamin und 1 % (V/V) ITS. Für jeden Mediumtyp gab es eine mit 2 mL versorgte Gruppe und eine weitere mit 5 mL. Jede dieser Bedingungen fand sich in einer 8- und einer 16-tägig geführten Gruppe wieder. Als Kontrollen wurden 10 Chips direkt nach der Biopsie ohne Kultivierung in Formaldehyd-Lösung fixiert und in Paraffin eingebettet. Auch die kultivierten Knorpel wurden bei Versuchsende so aufgearbeitet. Anhand der an Gewebeschnitten durchgeführten HE-Färbung und immunhistochemischen Methoden TUNEL bzw. M30 CytoDEATH® wurde der Vitalitätszustand der Chondrozyten bestimmt und am Lichtmikroskop quantifiziert. In Mediumüberständen wurden Glucose- bzw. Fructose- sowie Lactat- und LDH-Gehalt nach photometrischem Prinzip bestimmt und der pH-Wert gemessen. Die statistische Auswertung erfolgte nicht-parametrisch mit dem Kruskal-Wallis-(H-)Test und post hoc einem Bonferroni-korrigierten Mann-Whitney-U-Test. Dabei wurden i. R. des U-Tests Paare verglichen, die sich in nur einer Versuchsbedingung unterschieden.
Der Anteil histomorphologisch vitaler Zellen der nicht kultivierten Kontrollen lag bei durchschnittlich 90,8 ± 5,3 %, in den Versuchsgruppen global bei 66,4 ± 18,9 %. Während die Vitalität der Kontrollen das Zellüberleben des kultivierten Knorpels gesamt überstieg (geschätzter Lageunterschied ~Δ: 20,5 %; p-Wert < 0,05), gab es keine signifikanten Vitalitätsunterschiede zwischen den Versuchsgruppen für die i. R. des U-Tests durchgeführten Paarvergleiche. Letzteres galt auch für die Beurteilung des Zellüberlebens anhand des freigesetzten biochemischen Zelltodmarkers LDH. Der Kohlenhydratverbrauch betrug maximal ca. ein Viertel des Angebots. Er war in den Glucosegruppen während der ersten 12 Versuchstage sämtlich größer als in den entsprechenden Fructosegruppen (U-Test: ~Δ: 0,2-0,98 mg; p-Wert < α’ für alle Paarvergleiche, α’ = 0,05/12= 0,0042 nach Bonferroni). In den letzten beiden Inkubationsintervallen gab es diesen Unterschied in 25 % der Vergleiche bei ansonsten nicht signifikanten Differenzen. Ein Mehrangebot an Nährmedium förderte in den Paarvergleichen „2 mL vs. 5 mL“ mit signifikantem Unterschied (p-Wert < α’, α’ = 0,05/12= 0,0042) den Zuckerverbrauch (~Δ: 0,15-0,58 mg). Die Vergleiche für FCS ergaben, dass FCS in einigen Fällen zu einer signifikanten Erhöhung, in anderen zu einer Erniedrigung des Kohlenhydratstoffwechsels geführt hatte. Die chondrozytäre Lactatproduktion war mit einem ~Δ von 0,14 mg bis 0,64 mg (p-Wert < α’, α’ = 0,05/4= 0,0125) für alle 4 Paarvergleiche „Fructose vs. Glucose“ zu jedem Versuchszeitpunkt bis auf eine Ausnahme (p > α’) in den Glucosegruppen höher. Sie korrelierte negativ mit dem pH-Wert (Pearson-Koeffizient: -0,62; p-Wert < 0,05), der in den Fructosemedien im Versuchsverlauf ausnahmslos signifikant größer - i. e. näher an den physiologischen 7,4 (van den Berg, 2003) - als in den Glucosemedien war (~Δ: 0,11-0,39).
Als Fazit bleibt unter Berücksichtigung der eingangs gestellten Fragen dies festzuhalten:
1. FCS im Nährmedium bringt Chondrozyten keinen Überlebensvorteil und erhöht ihren Kohlenhydratstoffwechsel nicht. Somit kann es in dieser Hinsicht als Supplement nicht empfohlen werden.
2. Fructose kann Glucose im Medium ersetzen. Im Rahmen dieser Studie wurde meines Wissens erstmalig gezeigt, dass Knorpelzellen Fructose zur Energiegewinnung verstoffwechseln können. Ohne Auswirkung auf die Zellvitalität bewirkt Fructose im Vergleich zu Glucose eine niedrigere Kohlenhydratausschöpfung, Lactatproduktion und pH-Wert-Verschiebung in den Kulturmedien.
3. Der Nährstoffbedarf von Knorpel lag weit unter der angebotenen Menge und könnte in Zukunft auf ca. ein Drittel (~o,33 mg/L) reduziert werden. Bei höherem Zuckerangebot waren Kohlenhydratstoffwechsel, Lactatanfall und pH-Wert-Verschiebung ebenfalls größer, die Zellvitalität blieb unbeeinflusst. |
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| DOI: | 10.17192/z2013.0702 |