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Funktion und Mechanismus der Ethylbenzol Dehydrogenase
Typische Initialreaktionen anaerober Kohlenwasserstoffabbauwege sind die Hydroxylierung von Ethylbenzol und die Addition von Fumarat an Toluol oder Alkane. Die Hydroxylierung von Ethylbenzol zu (S)-Phenylethanol leitet den anaeroben Abbau von Ethylbenzol in denitrifizierenden Bakterien wie Aromatole...
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| 1. Verfasser: | |
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| Beteiligte: | |
| Format: | Dissertation |
| Sprache: | Deutsch |
| Veröffentlicht: |
Philipps-Universität Marburg
2013
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| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | PDF-Volltext |
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| Zusammenfassung: | Typische Initialreaktionen anaerober Kohlenwasserstoffabbauwege sind die Hydroxylierung von Ethylbenzol und die Addition von Fumarat an Toluol oder Alkane. Die Hydroxylierung von Ethylbenzol zu (S)-Phenylethanol leitet den anaeroben Abbau von Ethylbenzol in denitrifizierenden Bakterien wie Aromatoleum aromaticum ein. Diese sauerstoffunabhängige und stereospezifische Reaktion wird katalysiert durch die Ethylbenzol Dehydrogenase (EbDH), ein Molybdän/Eisen-Schwefel/Häm-Enzym aus der DMSO Reduktase Familie. Der anaerobe Abbau von Toluol in denitrifizierenden Bakterien wie Thauera aromatica und der anaerobe Abbau von Alkanen in den meisten sulfatreduzierenden Bakterien wird dagegen durch die Addition von Fumarat an die Methylgruppe von Toluol bzw. an das C2 Atom der Alkane eingeleitet.
Ziel dieser Arbeit war es den Reaktionsmechanismus der Ethylbenzol Dehydrogenase weiter aufzuklären sowie Untersuchungen zum Anwendungspotential des Enzyms durchzuführen. Außerdem wurden die ersten Untersuchungen zur Identifizierung eines neuartigen anaeroben Alkanabbauweges in dem sulfatreduzierenden Bakterium Desulfococcus oleovorans durchgeführt.
Anhand der Kinetik von Substraten und chemoinformatischen Berechnungen wurde ein Reaktionsmechanismus für die EbDH vorgeschlagen. In der vorliegenden Dissertation wurden enzymkinetische Untersuchungen mit alternativen Substraten und Inhibitoren durchgeführt, mit denen weitere Daten zur Bestätigung des postulierten Reaktionsmechanismus erhalten wurden. Das spezifische Verhalten bzw. die Kinetik der Substrate und Inhibitoren sowie die Natur der Hydroxylierungsprodukte der Substrate geben einen starken Hinweis auf die Existenz der vermuteten Radikal- und Carbokation-Intermediate im katalytischen Mechanismus des Enzyms. So wurde festgestellt, dass die Natur und Position bestimmter Substituenten am benzylischen Ring der Substrate die Reaktivität mit der EbDH positiv und negativ beeinflussen können, indem sie die vermuteten Radikal- und/oder Carbokation-Intermediate stabilisieren oder destabilisieren. Im Gegensatz dazu können mit den EbDH Inhibitoren die Energiebarrieren zur Bildung der Radikal- und/oder Carbokation-Intermediate nicht überwunden werden. Zudem konnte in dieser Arbeit eine neuartige Klasse von Inhibitoren in Form von BN-CC Isosteren von Ethylbenzol identifiziert werden (Azaborine). Diese Untersuchungen zeigen zum ersten Mal, dass künstliche Azaborin-Derivate von organischen Verbindungen biologische Aktivität aufweisen und erbringen daher den Nachweis des Konzepts das BN-CC Isosterie zu neuartigen Verbindungen mit neuartigen Eigenschaften führen kann.
Eine weitere Untersuchung in dieser Arbeit war die Bestimmung der Enantioselektivität der Wasserstoffabspaltung vom C1 Atom des Ethylsubstituenten von Ethylbenzol als initialem Schritt des Reaktionsmechanismus. Dazu wurden spezifisch deuterierte Ethylbenzolderivate synthetisiert die am C1 Atom des Ethylsubstituenten jeweils ein Deuteriumatom an Stelle eines Wasserstoffatoms in (S)- oder (R)-Konfiguration tragen. Mit enzymkinetischen Untersuchungen wurden kinetische Isotopeneffekte gemessen werden, die darauf hinweisen, dass wie für den initialen Schritt des Reaktionsmechanismus postuliert, der pro(S) Wasserstoff abgespalten wird.
Zur Bestimmung des kinetischen Modells des Reaktionsmechanismus der EbDH wurden enzymkinetische Untersuchungen mit zwei ausgewählten Substraten und zwei ausgewählten artifiziellen Elektronenakzeptoren durchgeführt. Die Auswertung der Daten ergab, dass das Enzym höchstwahrscheinlich einem Ping-Pong Mechanismus folgt.
Das sulfatreduzierende Bakterium Desulfococcus oleovorans verwendet für den anaeroben Alkanabbau keine Fumarat-Additionsreaktion wie andere bekannte alkanabbauende Mikroorganismen, sondern eine unbekannte Initialreaktion. Zur Identifizierung dieser Initialreaktion wurde D. oleovorans in der vorliegenden Dissertation mit Alkanen bzw. Fettsäuren als Kohlenstoff- und Elektronenquelle anaerob kultiviert und mit dem Zellextrakt der Kulturen proteomische Analysen durchgeführt. Dabei wurde festgestellt, dass drei Proteine ausschließlich in den Kulturen die auf Alkanen gewachsen waren, induziert sind. Eine massenspektrometrische Analyse dieser induzierten Proteinbanden ergab, dass es sich dabei um die drei Untereinheiten eines Ethylbenzol Dehydrogenase-ähnlichen Enzyms handelt. Die Aminosäuresequenz dieses Enzyms zeigt eine hohe Sequenzidentität zur Ethylbenzol Dehydrogenase. Aus diesem Grund wird postuliert, dass der Alkanabbau in D. oleovorans durch eine sauerstoffunabhängige Hydroxylierung der Alkane initiiert wird. |
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| DOI: | 10.17192/z2013.0090 |