The Role of Water in Protein-Ligand Binding: A Comprehensive Study by Crystallography and Isothermal Titration Calorimetry

Diese Arbeit befasst sich unter anderem mit den Folgen von Desolvationseffekten, die bei der Protein-Ligand-Wechselwirkung auftreten. In allen Komplexen mit Thrombin und den untersuchten Pyridin-Liganden werden Wassermoleküle entdeckt, die in unterschiedlicher Art so gut es geht den ursprünglichen Solvatationszustand zu konservieren versuchen. Die damit verbundenen entropischen Verluste sind immens. In zwei Ligandkomplexen finden sich sogar ungeordnete Ligandbestandteile in der S1 Tasche als Folge von Desolvatationseffekten. Der Preis für die Desolvatation einer geladenen Aminosäure ist einfach zu groß, um in diesem Fall eine komplette Verdrängung des Wassermoleküls zu gewährleisten. Die Komplexstrukturen zeigen zudem, dass die geladenen Methylpyridinium-Derivate nicht optimal das am Boden lokalisierte negativ geladene Asp189 adressieren können. Entweder lässt sich aus sterischen Gründen kein kurzer Abstand erreichen oder die Methylgruppe bietet einen zu guten Schutz, um über eine kurze Entfernung mit dem negativen Asp189 zu interagieren. Daher kann die Energie für die Desolvatation nicht durch die freiwerdende Energie aus der Interaktion zwischen dem Methylpyridinium und dem Asp189 aufgebracht werden. Zudem wurden Wassereffekte bei der hydrophoben Wechselwirkung in Thrombin und Thermolysin untersucht. Die thermodynamische Charakterisierung zeigt einen hydrophoben Effekt in Thrombin, der eindeutig entropisch getrieben ist. In dieser Studie ist die S3/4 Tasche mithilfe der immer größer werdenden hydrophoben Modifizierungen schrittweise desolvatisiert worden. In beiden Serien verbessert sich die Bindungsaffinität um das 40-fache. Ausgehend von einer nanomolaren Aktivität ist die Bindungsaffinität in den niedrigen pikomolaren Bereich hydrophob optimiert worden. Die Benzamidin-Derivate sind sogar durch einen Bindungsmodus mit zwei gebundenen Liganden gekennzeichnet. Überraschenderweise zeigt dieser Bindungsmodus eine bemerkenswerte Ähnlichkeit mit dem Bindungsmodus von Fibrinopeptid A. Die S2‘ Tasche von Thermolysin ist dagegen weniger gut geformt, aber dafür wegen ihrer Lage auf der Oberfläche optimal solvatisiert. Die Liganden für die S2‘ Tasche unterscheiden sich nur durch eine terminale Carboxylat- und/oder eine Methylgruppe. Eine überraschende Nicht-Additivität von Beiträgen einer Carboxylat- und/oder Methylgruppe ist festgestellt worden. Das Hinzufügen einer Methylgruppe bewirkte eine kleine Zunahme in der Freien Energie mit kleinen Änderungen in der Enthalpie/Entropie, während das im nächsten Schritt carboxylierte Derivat mit einem starken Affinitätssprung und großen Änderungen in der Enthalpie/Entropie begleitet war. Wurde das Carboxylat jedoch zuerst und dann erst die Methylgruppe eingefügt, wurden umgekehrte Effekte beobachtet: jetzt war die saure Gruppe von geringfügigen Effekten begleitet, während die zusätzliche Methylgruppe enorme Veränderungen verursachte. Die Carboxylat-Gruppe stört in beiden Komplexen das lokale Wassernetzwerk. Die zusätzliche Methylgruppe bietet dagegen günstige Wechselwirkungen für zusätzliche Wassermoleküle an. In fast allen Komplexen wird ein zusammenhängendes Wassernetzwerk zwischen den funktionellen Gruppen des Proteins und des Liganden beobachtet. Bei der Komplexstruktur mit dem carboxylierten Liganden fehlt die endständige Methylgruppe und dadurch bricht das Wassernetzwerk zusammen. Dieser Zusammenbruch der Wasserkette ergibt die überraschende thermodynamische Signatur mit nur geringen Affinitätsunterschieden bei dem carboxylierten Liganden, dem die Methylgruppe fehlt. Eine zusätzliche Methylgruppe dagegen hat günstige Interaktionsstellen für Wassermoleküle geschaffen und das Netzwerk wurde wieder hergestellt, begleitet von starken Affinitätsänderungen und einer enormen Änderung in der Enthalpie/Entropie. Die Adressierung der S2‘ Tasche zeigt ebenfalls ein entropisch dominiertes Signal. Die vorliegende Reihe von eng verwandten Liganden zeigt, dass beide thermodynamischen Parameter betroffen sind und dass viele kleine strukturelle Änderungen das thermodynamische Profil bestimmen. Wenn ein zusammenhängendes Wassernetzwerk zusammenbricht, zeigen sich deutliche Verluste in der Enthalpie, während die Entropie stark zunimmt. Insbesondere bei der Bindung von Liganden in offene hydrophobe Taschen, die leichten Zugang zu Wasser haben, können sich neue Bindestellen für Wassermoleküle ergeben, wenn Ligandenbereiche zur Wasserphase ausgerichtet sind. In unserer Studie wurde zum Beispiel ein zusätzliches Wassermolekül über dem Carboxylat (capping position) und an der Seite des Benzolrings entdeckt. Abschließend kann man feststellen, dass die hydrophobe Interaktion weder als entropisch noch enthalpisch beschrieben werden kann. Kleine strukturelle Veränderungen auf molekularer Ebene bestimmen darüber, welche treibenden Kräfte hinter der Bindung von hydrophoben Bindungspartnern stehen.