Functional characterization of ATP-dependent chromatin remodelers of the CHD family of Drosophila

Mitglieder der CHD Familie (Chromodomain-Helicase-DNA binding) chromatin-modifizierender Proteine spielen eine zentrale Rolle in unterschiedlichen Schritten des Transkriptionszyklus. Sie sind für die Regulation von Entwicklungs- und Differenzierungsprogrammen in mehrzelligen Organismen essentiell. Die Komplexität dieser Proteine erschwert allerdings ihre genauere Untersuchung in höheren Eukaryoten. In der vorliegenden Arbeit wurde daher auf den Modellorganismus Drosophila melanogaster zurückgegriffen, der lediglich über vier Mitglieder der CHD Familie verfügt. Im ersten Teil der Arbeit wurde dCHD3, ein neuentdecktes Mitglied der CHD Familie, biochemisch und funktionell charakterisiert. dCHD3 ist dMi-2, einem anderen CHD Familienmitglied, sehr ähnlich und besitzt folglich ähnliche enzymatische Aktivitäten in vitro. dCHD3 ist ein hochgradig aktives, durch Nukleosomen stimuliertes ATP-abhängiges Chromatin-modifizeirendes Enzym, das Mononukleosomen in vitro verschiebt. Die Chromo-Domänen von dCHD3 scheinen für Substraterkennung und die Aktivität dieses Enzyms wichtig zu sein. Trotz der Ähnlichkeiten in diesen Belangen, unterscheiden sich dCHD3 und dMi-2 in anderer Hinsicht deutlich. Im Gegensatz zu dMi-2 liegt dCHD3 in vivo als Monomer vor und ist mit keiner Deazetylierungsaktivität assoziiert. Darüberhinaus ist die Expression von dCHD3 auf frühe Entwicklungsstadien und bestimmte Gewebe beschränkt. dCHD3 ist zudem nicht in der Lage, einen Verlust von dMi-2 zu kompensieren, was dafür spricht, dass beide Proteine funktionell nicht redundant sind. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Beteiligung von dMi-2 in aktiver Transkription untersucht. dMi-2 spielt als Bestandteil der dNuRD und dMec-Komplexe bekanntermaßen bei der transkriptionellen Repression von Genen eine Rolle. Diese Arbeit zeigt hingegen, dass dMi-2 mit transkriptionell-aktiven Bereichen auf Polytänchromosomen kolokalisiert und zu Hitzeschock-Genen rekrutiert wird. Sowohl die Verringerung der Expression von dMi-2 als auch Überexpression einer katalytisch-inaktiven Mutante verringern die Hitzeschockantwort in Fliegen. Interessanterweise ist bei einigen dieser Gene die 3‘-Prozessierung und das Spleissen beeinträchtigt. In Übereinstimmung mit diesen Beobachtungen bindet dMi-2 im Verlauf der Hitzeschockinduktion an hsp Transkripte, die im Entstehen begriffen sind. Insgesamt deuten diese Resultate auf eine Funktion von dMi-2 bei der kotranskriptionellen RNA-Prozessierung hin. Die Untersuchung der Rekrutierung von dMi-2 zu Hitzeschock-Genen deutet darauf hin, dass sie in einer Poly-(ADP-Ribose)-abhängigen Weise stattfindet. Mehrere Ergebnisse unterstützen diese Hypothese. Erstens ist die Rekrutierung von dMi-2 zum hsp70 Gen verringert, wenn PARP inhibiert wird. Zweitens bindet dMi-2 PAR Polymere in vitro und mehrere Regionen, die PAR in vitro unabhängig binden, wurden identifiziert. Drittens ist eine dMi-2 Mutante, deren PAR-Binderegionen entfernt wurden, nicht in der Lage, in vivo zu aktiven Hitzeschockloci zu lokalisieren. Weiterhin konkurrieren RNA und PAR um Bindung an dMi-2. Insgesamt deuten die Ergebnisse auf einen zweischrittigen Mechanismus hin, der zur Assoziierung von dMi-2 mit aktiven Hitzeschock-Genen führt. Zuerst wird dMi-2 mittels Bindung an PAR zum Locus rekrutiert, bindet daraufhin aber an neuentstandene Transkripte. Insgesamt deuten die vorliegenden Ergebnisse daraufhin, dass die stress-induzierte Modifikation von Chromatin durch PARP als Gerüst für die Rekrutierung von Faktoren dient, die ihrerseits für eine schnelle und effiziente transkriptionelle Antwort notwendig sind.