Functional analysis of non-viral miRNA replacement therapy in colon carcinoma in vitro and in vivo

MicroRNAs (miRNAs) sind kleine RNA-Moleküle mit vollständiger oder unvollständiger Homologie zu ihrer Ziel-mRNA. Damit sind sie in der Lage, spezifisch die Expression einzelner Proteine zu beeinflussen. MicroRNAs spielen eine wichtige Rolle in der Krebs- Pathogenese, indem einige miRNAs gegen Onkogene gerichtet sind und somit als Tumor- Suppressoren fungieren, während andere miRNAs Onkogene darstellen und gegen Tumor- Suppressoren gerichtet sind. MiRNAs können somit direkt oder indirekt an wichtigen zellulären Prozessen wie Proliferation, Differenzierung und Apoptose beteiligt sein. Das Verständnis ihrer Funktionen und ihrer Relevanz könnte zur Entwicklung neuer Strategien in der Kontrolle von Tumoren führen. Diese Arbeit untersuchte die Möglichkeit und Effizienz nicht-viraler Einschleusungssysteme für miRNAs in Tumor-Zellen. Hierzu wurden zunächst in vitro drei verschiedene Transfektionsreagenzien, lineares Jet-PEI, verzweigtes PEI F25-LMW und INTERFERin untersucht, die entweder kommerziell erhältlich oder im Labor hergestellt worden waren. Die Experimente konzentrierten sich auf das Kolonkarzinom als Tumormodell, und zwei repräsentative Zelllinien, LS174t und HCT-116, wurden für die Experimente ausgewählt. Als miRNAs wurden miR-143 und miR-145 eingesetzt, auf deren Rolle in Tumorentstehung und in Tumorprogression es aus Vorstudien bereits Hinweise gab. Es wurde in miRNA-Transfektionsexperimenten gefunden, dass miR-143 und miR-145, deren Level im Kolonkarzinom vermindert sind, die Tumorprogression durch verschiedene regulatorische Mechanismen wie Proliferation und Apoptose steuern können. Wichtige Gene mit funktioneller Relevanz in Tumorigenese und Tumor-Progression wurden durch miR-143 und miR-145 negativ reguliert. So wurde ERK5 (mitogene activated protein kinase), das eine wichtige Rolle in der Proliferation von Kolonkarzinom- Zellen spielt, durch miR-143 und miR-145 supprimiert. Gleichfalls wurde eine negative Regulation von c-Myc durch miR-145 ermittelt, jedoch nur auf Proteinlevel und nicht auf der Ebene der Transkription. Es wurde ferner gefunden, dass die inhibierenden Effekte abhängig waren von verschiedenen Einflüssen und Parametern wie Zelllinie, Transfektionsreagenz, Inkubationszeit und Konzentration des miRNA-Komplexes. Die zelluläre Einschleusung der microRNAs miR-143 und miR-145 zeigte folglich deutliche inhibierende Effekte auf die Proliferation und die Soft-Agar Kolonienbildung von LS174t und HCT-116-Zellen, sowie eine Apoptose-Induktion in LS174t-Zellen. Weiterhin wurden die Tumor-inhibierenden Effekte von miR-145 in vivo untersucht. Hierzu wurden athymische Nacktmäuse mit s.c. Tumor-Xenotransplantaten mit PEIkomplexierter miR-145 durch systemische oder lokale Injektion behandelt. Es wurden nach der PEI-vermittelten miRNA-Einschleusung deutliche Antitumor-Effekte beobachtet, die wiederum auf der Herunterregulation von spezifischen tumorrelevanten Zielgenen basierten. Zusammenfassend kann die miRNA replacement therapy somit einen viel versprechenden neuen Ansatz in der Tumorbehandlung darstellen, und diese Arbeit etabliert die PEIvermittelte therapeutische Einschleusung von miR-145 in vivo in Kolonkarzinom- Xenotransplantaten.