Publikationsserver
Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen von Hydroxycinnamoyltransferasen aus Coleus blumei und Glechoma hederacea
Hydroxyzimtsäureester sind bedeutende sekundäre Inhaltsstoffe der Lamiaceae. Neben Hydroxycinnamoylshikimat und -chinat, die im Pflanzenreich nahezu ubiquitär verbreitet sind, ist Rosmarinsäure hauptsächlich in den Boraginaceae und der Unterfamilie Nepetoideae der Lamiaceae zu finden. Die Biosynthes...
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Beteiligte: | |
| Format: | Dissertation |
| Sprache: | Deutsch |
| Veröffentlicht: |
Philipps-Universität Marburg
2010
|
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | PDF-Volltext |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Zusammenfassung: | Hydroxyzimtsäureester sind bedeutende sekundäre Inhaltsstoffe der Lamiaceae. Neben Hydroxycinnamoylshikimat und -chinat, die im Pflanzenreich nahezu ubiquitär verbreitet sind, ist Rosmarinsäure hauptsächlich in den Boraginaceae und der Unterfamilie Nepetoideae der Lamiaceae zu finden. Die Biosynthesewege dieser Phenylpropanderivate sind aufgrund weitgehend verstanden. Die Hydroxycinnamoyltransferasen (HCTs), die an der Biosynthese dieser Ester beteiligt sind, gehören zur Superfamilie der BAHD-Acyltransferasen und übertragen Hydroxyzimtsäurereste von Hydroxycinnamoyl-CoA-Derivaten auf verschiedene Akzeptoren (HST: Shikimat, HQT: Chinat, RAS: Hydroxyphenyllactat). Dabei sind sie in der Regel sehr spezifisch für ihre Substrate.
Mit der Klonierung einer cDNA aus Coleus blumei, die für eine Hydroxycinnamoyl-CoA: Hydroxyphenyllactat Hydroxycinnamoyltransferase (CbRAS) codiert, gelang es Berger et al. (2006) erstmals, das Gen des charakteristischen Enzyms der Rosmarinsäurebiosynthese zu isolieren. Aus derselben Pflanzenart konnte in dieser Dissertation die cDNA, die für eine Hydroxycinnamoyl-CoA:Shikimat Hydroxycinnamoyltransferase (CbHST) codiert, isoliert werden. Beide Proteine wurden in E. coli heterolog exprimiert und die Substratspezifitäten untersucht. Beide HCTs besitzen eine breitere Substratspezifiät als erwartet und können neben Estern auch Amide bilden. Die CbHST überträgt CoA-aktivierte Zimtsäuren (p-Cumaroyl-CoA, Caffeoyl-CoA, Cinnamoyl-CoA, Feruloyl-CoA und Sinapoyl-CoA) auf Shikimat, nicht aber auf Chinat oder die Akzeptorsubstrate der CbRAS. Mit 3-Hydroxyanthranilsäure, 2,3-Dihydroxybenzoesäure, 3-Hydroxybenzoesäure und 3-Aminobenzoesäure wurde ebenfalls eine Produktbildung beobachtet. Die CbRAS überträgt dieselben CoA-aktivierten Zimtsäuren (außer Sinapoyl-CoA) auf D-p-Hydroxyphenyllactat (pHPL), D-Dihydroxyphenyllactat (DHPL) und D-Phenyllactat, nicht aber auf Chinat oder Shikimat. Die D-Aminosäuren D-Phenylalanin, D-Tyrosin und D-DOPA sind ebenfalls Substrate der CbRAS. Die Km-Werte für ein spezifisches Substrat waren immer abhängig von dem zweiten, konstant gehaltenen Substrat. Dies ist ein Hinweis für die Plastizität der aktiven Zentren (induced fit). Die Koexistenz beider Enzyme in einer Pflanzenart, die ausgeprägte Substratspezifität und der Vergleich der enzymkinetischen Parameter führt zu dem Ergebnis, dass es sich bei der CbHST und der CbRAS um spezifische Enzyme der Monolignol- (CbHST) bzw. der Rosmarinsäuresynthese (CbRAS) handelt, deren bevorzugtes Donorsubstrat p-Cumaroyl-CoA ist.
Zur Identifizierung von funktionell und/oder strukturell wichtigen Aminosäuren wurden gezielt die CbRAS-Mutanten H152A, D156A, D377A, R285A, W380L und L136P generiert. Die Einzelmutationen in diesen konservierten Bereichen führten zu einer drastischen Reduktion der Enzymaktivität (Restaktivität unter 1%). Vermutlich ist das H152 des 152HxxxD156-Motivs die katalytische Base. Es wurden zwei verschiedene Aufreinigungsverfahren entwickelt, mit deren Hilfe die CbRAS im zweistelligen mg-Bereich bis zur apparenten Homogenität aufgereinigt werden konnte. In ersten Kristallisationsversuchen wuchsen erste kleine Kristalle, bei denen es sich wahrscheinlich um CbRAS-Proteinkristalle handelt.
Glechoma hederacea produziert Rosmarinsäure und Chlorogensäure nebeneinander. Daher ist sie für die Untersuchung aller drei Biosynthesewege geeignet. Durch Nukleotidsequenzvergleich von bekannten RAS, HST und HQT wurden degenerierte Primer abgeleitet, die unter Verwendung der RACE-PCR-Technik zur selketiven Amplifikation von sechs cDNA-Klonen führten. Die translatierten Proteinsequenzen weisen die für BAHD-Acyltransferasen typischen konservierten Motive HxxxD und DFGWG auf. Drei Enzyme konnten funktionell in E. coli exprimiert werden: GhRAS-l ist eine Hydroxycinnamoyl-CoA:Hydroxyphenyllactat Hydroxycinnamoyltransferase, die spezifisch p-Cumaroyl-CoA und Caffeoyl-CoA auf pHPL und DHPL, nicht aber auf Shikimat oder Chinat überträgt. Die GhHST-k und die GhHST-l übertragen die beiden CoA-aktivierten Säuren selektiv auf Shikimat, nicht aber auf pHPL, DHPL oder Chinat. Die GhRAS-k mit 91% Sequenzidentität zur aktiven GhRAS-l war in Enzymtests nicht aktiv. Ein Pseudogen wird vermutet. Die putative GhHQT-k und die putative GhHQT-l weisen die höchste Aminosequenzähnlichkeit (50 % und 45 %) zur HQT aus Cynara cardunculus auf. Sie waren in Enzymtests jedoch nicht aktiv. Daher bleibt fraglich, ob es sich um HQTs oder um Enzyme mit bislang unbekannter Enzymaktivität handelt.
Die Verwandtschaftsverhältnisse der isolierten RAS-, HST- und putativen HQT-Sequenzen aus Coleus und Glechoma zu bekannten BAHD-Acyltransferasen zeigt die enge evolutionäre Beziehung der HCTs zueinander und gibt einen Hinweis, dass RAS, HST und HQT möglicherweise durch Genverdopplung und Diversifikation auseinander hervorgegangen sind. |
|---|---|
| DOI: | 10.17192/z2010.0168 |