Toxicological Evaluation of Poly(ethylene imine) -based non-viral vector systems for pulmonary siRNA application

Die vorliegende Arbeit beschreibt die Toxizität von Polyethylenimine (PEI)-basierten nicht-viralen Vektorsystemen für die pulmonare Verabreichung von siRNA und zeigt die toxikologische Analyse dieser Carrier in vitro als auch in vivo. Kapitel 1 führt in die Lungenanatomie sowie –physiologie ein und gibt allgemeine Hinweise, die bei einer pulmonaren Applikation von Bedeutung sind. Außerdem wird ein Überlick gegeben überzwei bedeutende Gruppen von nicht-viralen Vektorsystemen für eine pulmonare Verabreichung und die Bedeutung dieser Klassen im Zusammenhang mit Nanomedizin und Nanotoxikolgie dargestellt. Die Entwicklung und der Nutzen von geeigneten in vitro Toxizitätsscreening-möglichkeiten für polymer-basierte nicht-virale Vektorsysteme zur besseren Vorhersage ihrer Toxizität in vivo stellt eine große Herausforderung an alle Wissenschaftler im Bereich der Nanomedizin dar und ist in Kapitel 1 besonders hervorgehoben werden. Kapitel 2 beschreibt die toxikologischen und immunmodulatorischen Effekte von zwei PEI-basierten Nanocarriern für siRNA Freisetzung in verschiedenen Mauszelllinien. Die Ergebnisse zeigen eine deutlich höhere Empfindlichkeit der alveolaren Epithelzellen nach Behandlung mit PEI, wobei die Polyplexe eine geringere Toxizität aufweisen als die reinen Polymere. Kapitel 3 postuliert, dass die Kopplung von Polyethylenglycol (PEG) an PEI die Zytotoxizität von hochmolekular, verzweigtem PEI 25kDa reduzieren kann und untersucht die Zell-Kompatibilität und Zytotoxizität von mehreren unterschiedlich PEGylierten PEI-PEG Copolymeren in vitro. Diese in vitro Studie zeigt klar, dass mit zunehmender PEGylierung die Zytotoxizität zwar abnimmt, dafür aber das entzündungsfördernde Potential der PEG-PEI Copolymere zunimmt.Ausgehend davon, dass eine möglicherweise auftretende Entzündungsantwort und ein oxidativer Stresseffekt eine entscheidende Rolle bei der Verabreichung und Anwendung solcher PEI-basierten Nanocarrier, vor allem für die pulmonareAnwendung, spielt, beschreibt Kapitel 4 ein Toxizitäts- und Stress-basiertes Genexpressionsprofiling für ausgewählte PEI-PEG Polymere. Dieser Genarray hebt wiederum deutlich das entzündungsfördernde Potential der PEI-PEG Copolymere gegenüber dem reinen PEI 25kDa hervor. Wegen des erhöhten entzündungsfördernden Potentials und der verstärkten oxidativen Stressantwort, wurde die Frage einer möglichen Genotoxizität der PEI-basierten Polymere in Kapitel 5 untersucht. Die Mutationsfrequenz von ausgewählten PEI-basierten Polymeren wurde in einem transgenen Lungenepithel-Zellkultur-Model getestet. Es konnte gezeigt werden, dass das mutagene Potential von diesen PEI-basierten Nanocarriern in diesem Model als sehr gering ist. Nachdem die Toxizität in vitro ausführlich getestet wurde, stellten sich folgende zwei Fragen: a) Was für Effekte werden hervorgerufen nach direkter pulmonarer Verabreichung der Polymere oder ihrer Polyplexe in der Lunge? b) Gibt es eine mögliche in vitro/in vivo Korrelation für einen oder mehrere Biomarker, die Hinweise auf Toxizität, Entzündung und oxidativen Stress geben? Kapitel 6 beschäftigt sich in erster Linie mit der Beurteilung der Toxizität, Entzündung und der oxidativen Stressantwort in vivo nach intratrachealer Verabreichung von ausgewählten PEI-basierten Nanocarriern für siRNA in Mäusen und versucht die oben genannten zwei Fragen zu beantworten. Fast alle modifizierten PEI-basierten Nanocarrier zeigen eine sehr starke, akute Entzündungsreaktion in der Lunge. Hydrophobe Modifikationen an gering molekularem PEI 8.3kDa, als auch hydrophile, stark PEGylierte PEI 25kDa Copolymere scheinen gut vertragen zu werden, im Gegensatz zu eher weniger PEGylierten PEI 25kDa Copolmeren und Fettsäure-modifizierten PEI8.3kDa Copolymeren, die eine sehr starke und anhaltende Einzündungsreaktion in der Lunge hervorrufen.Zusätzlich zu den Toxizitätsstudien, die den Hauptteil der vorliegenden Arbeit ausmachen, wird in Kapitel 7 die Wirksamkeit und ein Zelltyp spezifisches Targeting von PEI-basierten Nanocarriern nach intratrachealer Verabreichung in transgenen EGFP-Mäusen untersucht. Interessanterweise zeigt sich, dass die, in Kapitel 6 beschriebenen stark entzündungsfördernden PEI-basierten Polymere die höchste Knockdown Effizienz aufweisen, allerdings mit einem hohen Anteil an off-Target Effekten. Nur das Fettsäure modifizierte PEI -Polymer scheint weniger bis keine off-Target Effekte zu erzeugen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Leukozytenpopulation zu einem gewissen Anteil Zielzellen nach Verabreichung der PEI-basierten siRNA-Komplexe in der Lunge darstellen, allerdings scheinen zusätzlich noch Epithel- oder auch Endothelzellen in der Lunge erreicht zu werden.