Charakterisierung eines Ustilago maydis Genclusters, das für drei neuartige sekretierte Effektoren kodiert

Der biotrophe Brandpilz U. maydis benötigt für seine Interaktion mit Maispflanzen eine Vielzahl neuartiger, vorhergesagt sekretierter Proteine, sogenannter Effektoren. Ein signifikanter Anteil der entsprechenden Gene liegt in Clustern vor, deren Expression erst während der biotrophen Phase erfolgt (...

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Main Author: Schipper, Kerstin
Contributors: Kahmann, Regine (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2009
Biologie
Subjects:
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:Der biotrophe Brandpilz U. maydis benötigt für seine Interaktion mit Maispflanzen eine Vielzahl neuartiger, vorhergesagt sekretierter Proteine, sogenannter Effektoren. Ein signifikanter Anteil der entsprechenden Gene liegt in Clustern vor, deren Expression erst während der biotrophen Phase erfolgt (Kämper et al., 2006). Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Cluster 5B charakterisiert, dessen Deletion zum Verlust der Pathogenität führt (Kämper et al., 2006). Cluster 5B codiert für drei Proteine, die ein N-terminales Signalpeptid besitzen. Es konnte gezeigt werden, dass ausschließlich eines der Gene im Cluster 5B, stp1, für den Phänotyp verantwortlich ist. stp1 findet sich auch in anderen verwandten Brandpilzen und stellt damit möglicherweise einen essentiellen Pathogenitätsfaktor von Brandpilzen dar. Mikroskopische Untersuchungen ergaben, dass stp1 Deletionsmutanten im Gegensatz zu Infektionen mit Wildtypstämmen direkt nach Penetration der Maisepidermis arretieren und in infizierten Pflanzenzellen eine verstärkte Abwehrreaktion auslösen. Diese Abwehrreaktion war durch Papillenbildung, H2O2 Akkumulation und verstärkte Synthese von PR-Proteinen gekennzeichnet und führte letztlich zum Absterben der infizierten Zellen. Dies zeigt, dass Stp1 diese Pfanzenabwehrreaktionen erfolgreich unterdrückt. Mit Hilfe von Promotor:gfp Fusionen wurde nachgewiesen, dass die Expression von Stp1 während der Pentration beginnt und vor allem auf in der Epidermis proliferierende Hyphen beschränkt ist. In Stp1 konnten bioinformatisch keinerlei bekannte Proteindomänen gefunden werden, die auf die Funktion des Proteins hindeuten könnten. Durch Deletionsanalysen konnte gezeigt werden, dass die zentrale, Glycin-reiche Region des Proteins keine Funktion während der pathogenen Entwicklung hat, die N- und C-terminalen Bereiche hingegen essentiell sind. Durch die Analyse von Kulturüberständen konnte nachgewiesen werden, dass Stp1 von U. maydis Hyphen in glykosylierter Form sekretiert wird. Nach Expression in haploiden Zellen wurde hingegen eine Prozessierung des Proteins durch die Kex2 Protease beobachtet. Die Ergebnisse deuten an, dass die Sekretion des Effektors einer genauen Kontrolle unterliegt, die sowohl transkriptionell als auch post-translational erfolgt. Durch konfokale Laserscanning-Mikroskopie konnte gezeigt werden, dass Stp1- Fusionsproteine während der biotrophen Wachstumsphase von U. maydis in den Apoplasten gelangen. In einer Hefe-Zwei-Hybrid-Analyse wurden ausschließlich intrazelluläre pflanzliche Interaktionspartner identifiziert. Stp1-Fusionsproteine, denen das N-terminale Signalpeptid fehlte, lokalisierten nach transienter Expression in Nicotiana benthamiana spezifisch in Subkompartimenten des Nukleus. Für einen der identifizierten Interaktionspartner konnte nach Co-Expression in N. benthamiana eine Colokalisierung mit Stp1 ohne Signalpeptid im Zellkern nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse könnten andeuten, dass Stp1 nach Sekretion in Pflanzenzellen transloziert wird und dort in die Regulation von Abwehrreaktionen eingreift.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2009.0723