Funktionelle Analyse von Cryptochrom 3 aus Arabidopsis thaliana

Cryptochrome sind Blau-/UVA-Photorezeptoren, die eng mit den Photolyasen verwandt sind, aber keine DNA-Reparaturaktivität besitzen. Neben den „klassischen“ pflanzlichen Cryptochromen cry1 und cry2 wurde in Arabidopsis thaliana mit Cryptochrom 3 (cry3) ein drittes Cryptochrom identifiziert. Dieses...

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Main Author: Reisbacher, Stefan
Contributors: Batschauer, Alfred (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2009
Subjects:
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Description
Summary:Cryptochrome sind Blau-/UVA-Photorezeptoren, die eng mit den Photolyasen verwandt sind, aber keine DNA-Reparaturaktivität besitzen. Neben den „klassischen“ pflanzlichen Cryptochromen cry1 und cry2 wurde in Arabidopsis thaliana mit Cryptochrom 3 (cry3) ein drittes Cryptochrom identifiziert. Dieses Cryptochrom aus der Familie der DASH-Cryptochrome wurde als plastiden- und mitochondrienlokalisiertes Protein beschrieben. Obwohl Cryptochrom 3 schon sehr gut strukturell und biochemisch charakterisiert ist, konnte die biologische Funktion dieses Proteins in der Pflanze bisher noch nicht aufgeklärt werden. In dieser Arbeit wurde daher die biologische Funktion von cry3 in der Pflanze untersucht. Die cry3-Lokalisation in Chloroplasten und Mitochondrien konnte durch Zellfraktionierung und Immunolokalisationsstudien eindeutig bestätigt werden. Damit konnten Artefakte bei den bisherigen Untersuchungen durch die Überexpression und GFP-Fusion von cry3 ausgeschlossen werden. Die CRY3-Expression wird auf der Transkript-Ebene durch Licht reguliert. CRY3 wird während der Deetiolierungsphase hauptsächlich durch dunkelrotes Licht transient induziert. Phytochrom A konnte als der hauptverantwortliche Photorezeptor für diese Reaktion identifiziert werden. An dieser phytochromabhängigen Regulation sind auch PIF1 und PIF3 beteiligt. In ergrünten Pflanzen unterliegt die CRY3-Expression einer circadianen Regulation, welche anscheinend auch durch die Photoperiode beeinflusst wird. Zur funktionellen Analyse von Cryptochrom 3 wurden cry3-Mutanten in verschiedenen Mutanten-Kollektionen identifiziert und außerdem verschiedene cry3-Linien hergestellt. Zur weiteren Untersuchung der cry3-Funktion steht eine cry3-Überexpressionslinie, eine RNAi-knock-down-Linie, eine cry3-knock-out-Linie mit einer Transposon-Insertion, verschiedene T-DNA-Insertionslinien mit veränderter CRY3-Expression bzw. verkürztem cry3 C-Terminus, sowie eine putative knock-out-Linie mit einer Punktmutation in der splicing Erkennungssequenz zur Verfügung. Zwei dieser Mutantenlinien waren in ihrer Keimungsfähigkeit unter spezifischen Bedingungen beeinträchtigt. Der Keimungsphänotyp konnte in dieser Arbeit allerdings nicht eindeutig belegt werden. Abgesehen von dieser reduzierten Keimrate waren bei den untersuchten transgenen cry3-Linien keine offensichtlichen phänotypischen Unterschiede festzustellen. Auch ein Einfluss von cry3 auf die Blau-, Grün- und UV-Licht-abhängige Regulation von plastidenkodierten Genen konnte nicht nachgewiesen werden. Das Wachstum von Arabidopsis unter erhöhter UV-B-Bestrahlung wird durch cry3 nicht beeinflusst. Für cry3 ist zwar in vitro eine Photolyasefunktion bei einzelsträngiger DNA und doppelsträngiger DNA mit loop-Strukturen beschrieben worden, dennoch sprechen die Ergebnisse dieser Arbeit gegen eine in vivo Funktion von cry3 als DNA-Reparaturenzym, weil durch einen PCR-basierten Reparatur-assay kein Einfluss von cry3 auf die DNA-Reparatur in Chloroplasten und Mitochondrien nachgewiesen werden konnte.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2009.0699