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Funktionelle Charaktersierung der Arginin Methyltransferase PRMT6
Das primäre Ziel der vorliegenden Arbeit bestand in der Untersuchung der Histonmethyltransferaseaktivität von PRMT6. Trotz der Tatsache, dass PRMT6 im Zellkern lokalisiert ist und für einige andere PRMTs Histonmethylierung gefunden wurde, blieb die Argininmethylierung in Histonen durch PRMT6 bish...
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| Main Author: | |
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| Contributors: | |
| Format: | Doctoral Thesis |
| Language: | German |
| Published: |
Philipps-Universität Marburg
2009
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| Subjects: | |
| Online Access: | PDF Full Text |
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| Summary: | Das primäre Ziel der vorliegenden Arbeit bestand in der Untersuchung der
Histonmethyltransferaseaktivität von PRMT6. Trotz der Tatsache, dass PRMT6 im
Zellkern lokalisiert ist und für einige andere PRMTs Histonmethylierung gefunden
wurde, blieb die Argininmethylierung in Histonen durch PRMT6 bisher unerforscht.
Es konnte hier gezeigt werden, dass PRMT6 in vitro die Histone H3, H2A und H4
methyliert. Während ungebundene Histonproteine Substrate von PRMT6 waren, traf
dies für Histone in Nukleosomen in vitro nicht zu. Die Methylierungsstellen konnten in
den N-Termini der Histone lokalisiert werden und als R2 in Histon H3 sowie R3 in
Histon H4 und H2A identifiziert werden. Bei der Charakterisierung des
Methylierungsmechanismus ergab sich eine Präferenz von PRMT6 für monomethylierte
Arginine, was die PRMT6 als Methyltransferase ausweist, welche bevorzugt die
Dimethylierung von Argininen katalysiert. In Bezug auf die Methylierung des R2
konnten Einflüsse benachbarter Methylierungen auf die in vitro PRMT6-Aktivität
ausgemacht werden. So wirkten die Methylierungen an K4 und K9 inhibierend,
während die Methylierung des K27 einen schwachen positiven Effekt zeigte.
Das daran anschließende Ziel bestand in der Untersuchung der Funktion der H3R2
Dimethylierung im Zusammenhang des Histoncodes. Es sollten mögliche
Bindungsproteine (Effektor-Proteine) für diese Modifikation gefunden werden. Dazu
wurden Peptid-Pulldowns mit synthetisch modifizierten H3-Peptiden durchgeführt und
nach differentiell bindenden Proteinen gesucht. Diese Methode konnte allerdings keine
spezifischen Interaktionspartner identifizieren. Auch ein vermuteter Zusammenhang
zwischen der PRMT6 und dem PRC2-Komplex, sowie den entsprechenden
Modifikationen an R2 und K27 konnte mittels dieser Peptid-Pulldowns nicht betätigt
werden.
Frühere Studien der Lokalisation der R2 Di- bzw. der K4 Trimethylierung an
bestimmten Genpromotoren sowie Untersuchungen der Genexpression von c-Myc Zielbzw.
HoxA Genen bei PRMT6 Überexpression lieferten Hinweise auf einen repressiven
Effekt der PRMT6-vermittelten R2 Dimethylierung. Zur weiteren Überprüfung dieses
Mechanismus wurde zuerst die Genregulation des c-Myc Gens durch den Wnt-
Signalweg untersucht. Dabei konnte durch RNAi-vermittelte Depletion kein Einfluss
der PRMT6 auf die Genexpression dieses Gens gefunden werden.Um den negativen Effekt der R2 Dimethylierung auf die Trimethylierung des K4 auf
mechanistischer Ebene zu beschreiben, wurde die in vitro Aktivität der K4
Trimethyltransferase MLL sowie die Histon H3 Interaktion der MLL-Komplexkomponente
WDR5 in Abhängigkeit von der R2 Dimethylierung untersucht. Hierbei
konnte gezeigt werden, dass sowohl die Methyltransferaseaktivität von MLL wie auch
die Bindung des WDR5 an den Histon H3 N-Terminus durch eine Dimethylierung des
R2 verhindert wird. Der inhibitorische Effekt der R2 Methylierung auf die
Methylierung des K4 konnte spezifisch durch Chromatin-IPs in vivo am HoxA2
Promotor nachgewiesen werden, wo eine PRMT6 Überexpression zu verstärkter
PRMT6 Rekrutierung und R2 Dimethylierung führte. Diese wiederum hatte die
verminderte Assoziation von MLL und WDR5 mit diesem Promotor zur Folge und
somit eine Reduktion der Trimethylierung des K4. In einem Modell neuronaler
Differenzierung konnten diese Ereignisse am HoxA2 Gen bestätigt werden und
zusätzlich die repressive Funktion der PRMT6-vermittelten R2 Dimethylierung auf die
Genexpression aufgezeigt werden.
Zusammenfassend charakterisieren die Daten dieser Arbeit PRMT6 als neue
Histonmethyltransferase, die R2 in Histon H3 dimethyliert. Desweiteren wurde eine
spezifische Genregulationsfunktion der PRMT6 im Zusammenhang mit dem Histon-
Code identifiziert, bei welcher die H3K4Me3-vermittelte Expression bestimmter
Genpromotoren durch die H3R2Me2 reprimiert wird. |
|---|---|
| Physical Description: | 182 Pages |
| DOI: | 10.17192/z2009.0107 |