Identification and analysis of Dictyostelium discoideum microtubule associated proteins

Das Microtubuli Zytoskelett mit seinen dynamischen Enden ist für viele Funktionen in der Zelle während des gesamten Zellzykluses unerlässlich. Dabei interagieren bekanntermaßen microtubuli-assoziierte Proteine (MAPs) mit anderen Proteinen um all die komplexen Aufgaben rund um die dynamische Instabilität der Mikrotubuli, die Verankerung der Mikrotubuli am Zellcortex, die Kontrolle der Mitose am Centrosom und die Leitung des Transports entlang der Mikrotubuli zu gewährleisten. Fehlfunktionen dieser Proteine führen zu gravierenden Defekten einschließlich Krebs. Die Kenntnis der an diesen Komplexen beteiligen Proteine macht hierbei einen Großteil unseres Verständnisses dieser Prozesse aus. Um bisher unbekannte Proteine, die zu diesen Komplexen gehören, zu identifizieren, wurde im Modelorganismus Dictyostelium discoideum nach Interaktoren von gut charakterisierten und konservierten Proteinen gesucht. Von DdEB1 und DdCP224, dem Vertreter der XMAP215 Proteine in Dictyostelium discoideum, ist bekannt, dass sie sowohl Teil des Komplexes an den Mikrotubuli-Plus-Enden als auch desjenigen am Centrosom sind. DdCP224 spielt bei der Centrosomenduplikation und der Zytokinese eine Rolle, DdEB1 hingegen ist an der Bildung der Mitosespindel beteiligt. An den Plus-Enden der Mikrotubuli sind diese beiden Proteine Teil des Komplexes, der die Mikrotubuli vermutlich mit dem Zellcortex verbindet. In dieser Arbeit wurden nun zwei Ansätze ausgewählt, um die Suche nach neuen Interaktoren aufzunehmen. Mit Hilfe des Hefe-2-Hybrid Systems wurden fünf mögliche Interaktoren von DdEB1 und DdCP224 entdeckt, die nicht mit andere Methoden bestätigt werden konnten. Die sogenannte „Tandem affinity Purification“ (TAP), die ursprünglich in Hefe entwickelt wurde, stellt eine sehr sanfte und effiziente Methode dar, nach Proteininteraktionen zu suchen. Sie wurde in dieser Arbeit zur Nutzung in Dictyostelium discoideum angepasst und stellte sich als nützliche Methode zur spezifischen Isolation und Identifizierung Mikrotubuli assozierter Proteinkomplexe heraus. Mit Hilfe der TAP und den Methoden der Massenspektrometrie konnte im Rahmen dieser Arbeit die Interaktion zwischen DdEB1 und DdCP224 erneut bestätigt werden. Zusätzlich fanden sich weitere Interaktoren, von denen die zwischen einem Protein der TACC-Familie und DdCP224 erstmalig in Dictyostelium discoideum gezeigt werden konnte. Diese Interaktion wurde durch die Kolokalisierung und Koimmunprezipitation der beiden Proteine bestätigt. Ähnlich wie in anderen Organismen genügt auch in Dictyostelium discoideum die TACC-Domäne für die Lokalisation des Proteins am Centrosom und die Interaktion mit dem XMAP215 Orthologen. DdTACC stellt das einzige Mitglied dieser Proteinfamilie in Dictyostelium discoideum dar und scheint, wie die Ergebnisse dieser Arbeit nahelegen, essentielle Aufgaben zu besitzen.