Rapid purification of human lysosomal membranes, characterisation of the detergent resistent microdomains, purification and reconstitution of the vacuolar proton pump (V-ATPase)

Eine Reinigung von lysosomalen Membranen aus humaner Plazenta, bei der sich die spezifische Aktivität der membranassoziierten ß-Glucocerebrosidase gegenüber dem Homogenat 300-fach anreichern ließ, wurde erzielt. Aus diesen Membranpräparationen konnte die vakuoläre H+-ATPase extrahiert und durch Gelfiltration weiter gereinigt werden. Dies ist die erste Beschreibung einer Solubilisierung und Anreicherung der V-ATPase aus humanem Gewebe. Weiterhin konnte gezeigt werden dass sich der Enzymkomplex aus detergenzresistenten Mikrodomänen (DRMs, rafts) durch Methyl-ß-cyclodextrin freisetzen ließ. Neben einigen V-ATPase Untereinheiten ließen sich die alkalische Phosphatase und Stomatin als weitere DRM-assoziierte Proteine durch Kombination von CETAB- und SDS-PAGE mit anschießendem MALDI-Massen-Fingerprint identifizieren, die unter Methyl-ß-cyclodextrin-Behandlung jedoch nicht freigesetzt wurden. Des Weiteren konnten in Rekonstitutionsversuchen 30 % der gereinigten V-ATPase-Aktivität in Cholesterol-haltigen und 14 % in Cholesterol-freien Liposomen erhalten werden. Die Aktivität der V-ATPase in den gereinigten lysosomalen Membranen und ebenso diejenige des in Liposomen rekonstituierten Enzyms erwies sich als vollständig mit dem Retinalderivat A2-E (10 µM) hemmbar. Dadurch wurde eine Basis für weitere Untersuchungen des pathogenetischen Potentials des A2-E geschaffen.