Regulation und Kinetik des Galaktosetransportes in der HXT NULL MUTANTE RE700 Saccharomyces cerevisiae

Galaktose-Gegentransportmessungen an Plasmamembranvesikeln präpariert aus mit Galaktose induzierten Zellen der Nullmutante RE700 ergaben folgende Km-Werte: 6,4, 6,5 und 5,3 mM. Damit ist zum erstenmal eindeutig der Mechanismus des ?facilitated diffusion? Transportes und die Kinetik des Galaktosetran...

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Main Author: Bruness, Christina
Contributors: Fuhrmann, Günter Fred (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2005
Subjects:
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Description
Summary:Galaktose-Gegentransportmessungen an Plasmamembranvesikeln präpariert aus mit Galaktose induzierten Zellen der Nullmutante RE700 ergaben folgende Km-Werte: 6,4, 6,5 und 5,3 mM. Damit ist zum erstenmal eindeutig der Mechanismus des ?facilitated diffusion? Transportes und die Kinetik des Galaktosetransporters Gal2 der Hefe bestimmt worden. Der Galaktosegegentransport an Plasmamembranvesikeln präpariert aus der Nullmutante RE700 nach Galaktose-Induktion zeigt im Vergleich zu dem mit Glukose ein deutlich niedrigeres Gegentransportmaximum, was bereits auf eine geringere Affinität von Galaktose zum Gal2 hinweist. Die entsprechenden Km-Werte aus sechs Versuchen des Glukose-Gegentransportes waren 3,9, 2,0, 4,0, 2,0, 2,2 und 2,3 mM. Der hieraus berechnete Mittelwert von 2,7 ± 0,4 mM entsprach damit der Hälfte des Km-Wertes aus dem Galaktosegegentransport mit 6,0 mM. Eine ebenso große Differenz der Km-Werte zwischen dem Transport von Galaktose und Glukose konnte bei initialen Aufnahmeversuchen an Zellen der Nullmutante RE700 nach Galaktose-Induktion erhoben werden. Aus 28 Einzelversuchen mit Galaktose als Transportsubstrat ergab sich ein Km-Wert von 3,7 ± 0,3 mM, der damit doppelt so hoch wie der bei der initialen Glukoseaufnahme lag mit einem Km-Wert von 1,8 ± 0,1 mM (46 Versuche). Im t-Test (?two-tailed?) erwies sich dieser Unterschied als hochsignifikant mit einem P-Wert < 0,0001. Der niedrige Km-Wert von 1,8 ± 0,1 mM bei der initialen Glukoseaufnahme bestätigt den berechneten Km-Wert aus den Gegentransport- versuchen von Maier mit 1,5 mM und liegt auch mit dem hier erhobenen Km-Wert von 2,7 ± 0,4 mM im Einklang. Der Km-Wert des initialen Galaktosetransportes beim Wildtyp 996A nach Galaktose-Induktion betrug in 8 Einzelversuchen 4,3 ± 0,7 mM und war somit nicht signifikant verschieden von dem entsprechenden Km-Wert der Nullmutante RE700 mit 3,7 ± 0,3 mM. Die niedrigen Km-Werte für Glukose mit 1,8 mM am Gal2-Transporter der Hefe sind in Übereinstimmung mit entsprechenden Km-Werten des menschlichen Glukosetransporters Glut1 aus der Literatur mit 1,6 und 2,4 mM [Stein90] [Fuhrmann89(1)]. Dagegen sind die Km-Werte für den Galaktosetransport mit 6 und 3,7 mM am Gal2 Transporter der Hefe deutlich verschieden gegenüber dem Km-Wert von 12 mM beim menschlichen Glut1 Transporter. Ein weiterer Unterschied besteht darin, dass der Hefetransporter Gal2 kein asymmetrisches Transportverhalten wie der menschliche Glut1 beim Erythrozyten aufweist. Damit ist nicht nur die Struktur sondern auch die Funktion beider Transporter verschieden. Durch die Anwesenheit von Glukose (?Glukoseshift?) wird eine Repression von Enzymen hervorgerufen. Beim Wildtyp 996A verschwindet der induzierte Galaktosetransporter Gal2 wieder vollständig. Der Abbau erfolgt exponentiell (Korrelationskoeffizient 0,955) mit einem K-Wert von 0,36 ± 0,06 und einer Halbwertzeit von 1,92 Stunden, sodass nach etwa 8 Stunden fast kein Galaktosetransport mehr nachzuweisen ist. Dieses Verhalten und der zeitliche Ablauf entsprechen in etwa den Angaben aus der Literatur [Galindez83] [Horak97]. Im Vergleich zu den Wildtyp-Hefezellen zeigt die Nullmutante RE700 beim ?Glukoseshift? ein signifikant anderes Verhalten, es wird nämlich nur etwa die Hälfte der induzierten Galaktosetransporter abgebaut. Dabei strebt die Abnahme der Galaktosetransporter auf ein Plateau zu. Es werden in diesen Versuchen 40 bis 53% der Galaktosetransporter nicht abgebaut und bleiben aktiv. Dabei ist die Geschwindigkeit des Teilabbaues der Galaktosetransporter schneller als beim Wildtyp 996A. Auf Grund der Streuung lässt sich jedoch hierbei keine exakte Kinetik bestimmen. Das Phänomen der Plateaubildung wurde in dieser Weise bisher noch nicht beobachtet und es ist nicht bekannt, warum die Nullmutante RE700 ihre Galaktosetransporter nicht vollständig abbaut wie Wildtypen der Hefen. Möglicherweise ist durch das Entfernen der Gene für die Glukosetransporter das empfindliche Zusammenspiel der verschiedenen Leloir-Enzyme bei der ?Downregulierung? des Gal2 in der Zelle gestört. Es ist außerdem vorstellbar, dass durch Ausfall der Glukosetransporter als Regulativ bei der Nullmutante ein noch nicht bekannter ?Selbsterhaltungstrieb? die Katabolitinaktivierung des Galaktosetransporters nach gewisser Zeit stoppt. Zur Abklärung dieses interessanten Phänomens sind weitere Versuche notwendig.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2005.0192