Die molekulare Logik der nichtribosomalen Peptidsynthetasen: Identifizierung und biochemische Charakterisierung der Biosynthesegene für Gramicidin A
Gramicidin ist ein Polypeptid, das aus 15 hydrophoben Aminosäuren mit alternierender L-D-Konfiguration besteht. In vivo bilden sich Homodimere, die in Membranen als Ionenkanäle fungieren. Die Primärstruktur von Gramicidin A lautet Formyl-Val1-Gly2-Ala3-DLeu4-Ala5-DVal6-Val7-DVal8-Trp9-DLeu10-Trp11-D...
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| 1. Verfasser: | |
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| Beteiligte: | |
| Format: | Dissertation |
| Sprache: | Deutsch |
| Veröffentlicht: |
Philipps-Universität Marburg
2005
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| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | PDF-Volltext |
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| Zusammenfassung: | Gramicidin ist ein Polypeptid, das aus 15 hydrophoben Aminosäuren mit alternierender L-D-Konfiguration besteht. In vivo bilden sich Homodimere, die in Membranen als Ionenkanäle fungieren. Die Primärstruktur von Gramicidin A lautet Formyl-Val1-Gly2-Ala3-DLeu4-Ala5-DVal6-Val7-DVal8-Trp9-DLeu10-Trp11-DLeu12-Trp13-DLeu14-Trp15-Ethanolamin. Das Peptid ist am N Terminus durch N Formylierung und am C Terminus durch Ethanolamin vor Abbau geschützt.
In der vorliegenden Arbeit wurde ein Genkluster von 61 kb aus B. brevis ATCC 8185 mit Hilfe einer Fosmid-Genbank identifiziert und vollständig sequenziert, der für die Gramicidin A - nichtribosomale Peptidsynthetase (NRPS) kodiert. Ein Multienzym-komplex bestehend aus den 4 NRPS LgrABCD mit jeweils 2, 4, 6 und 4 Modulen konnte für Aufbau und Modifizierung des Pentadekapeptids charakterisiert werden. In silico Untersuchungen zur Definition der Substratspezifität aller 16 Module wurde durch biochemische Untersuchungen an drei Adenylierungsdomänen (LgrA1, LgrA2 und LgrB1) gestützt. Damit konnte das Kolinearitätsprinzip dieser NRPS bewiesen werden.
Die putative C-terminale Reduktase (R) Domäne, die an Modul 16 fusioniert ist, deutete auf die Freisetzung des N-formylierten Peptidsubstrats als Alkohol hin. Biochemische Untersuchungen an der rekombinanten R-Domäne mit Peptidyl-Substratvarianten haben gezeigt, daß diese eine ein-Schritt-Reduktion unter NAD(P)H-Verbrauch zum Aldehyd-Intermediat durchführt. Durch die Verwendung von verschiedenen Substrat-Varianten konnte weiter gezeigt werden, daß die R Domäne eine breite Substrattoleranz besitzt.
Die Suche nach einer zweiten Reduktase, die das Peptidyl-Aldehyd zum Endprodukt Peptidyl-Ethanolamin umsetzt, hat zur Entdeckung der Aldoreduktase LgrE geführt. In gekoppelten Assays mit beiden rekombinanten Reduktasen konnte das Peptidyl-Ethanolamin produziert werden. Durch in vitro Umsetzung des enzymatisch hergestellten Peptidyl-Aldehyd-Intermediats mit LgrE konnte die strikte NADPH-Abhängigkeit dieses Enzyms gezeigt werden. Die Aldoreduktase wies im direkten Vergleich zur R Domäne eine stringentere Substratspezifität auf.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine Methode für Modulaustausche in NRPS auf genetischer Ebene entwickelt. Dabei wird zunächst ein Genfragment gekoppelt an einen Marker ins Genom durch homologe Rekombination eingebracht. Im zweiten Schritt wird der Marker über direct repeats durch Ausloopen wieder entfernt. Das Genfragment bleibt erhalten, und das neue NRPS-Produkt kann analysiert werden. |
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| DOI: | 10.17192/z2005.0092 |