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Protein-Histidin-Phosphatase: Strukturelle Eigenschaften und Identifizierung der ATP-Citrat-Lyase als Substrat
Für die Protein-Histidin-Phosphatase (PHP) wurde im Rahmen dieser Arbeit die ATP-Citrat-Lyase (ACL) als erstes physiologisches Substrat identifiziert. Weil eine konventionelle Phosphorylierung mit [gamma-32P]ATP in Gegenwart von Magnesiumionen eine Vielzahl phosphorylierter Proteine ergeben hätte, w...
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| Altres autors: | |
| Format: | Dissertation |
| Idioma: | alemany |
| Publicat: |
Philipps-Universität Marburg
2004
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| Matèries: | |
| Accés en línia: | PDF a text complet |
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| Sumari: | Für die Protein-Histidin-Phosphatase (PHP) wurde im Rahmen dieser Arbeit die ATP-Citrat-Lyase (ACL) als erstes physiologisches Substrat identifiziert. Weil eine konventionelle Phosphorylierung mit [gamma-32P]ATP in Gegenwart von Magnesiumionen eine Vielzahl phosphorylierter Proteine ergeben hätte, wurde eine Methode verwendet, die spezifisch am Histidin phosphorylierte Proteine aufzeigte. Die Phosphorylierung des löslichen Extraktes aus dem Gewebe der Kaninchenleber mit [gamma-32P]ATP und EDTA ergab drei Proteinbanden (20, 40, 110 kDa) bei SDS-PAGE. Nach Zugabe der PHP kam es zur Dephosphorylierung der 110 kDa-Bande.
Um das Substrat mit Hilfe von Sequenzanalysen zu identifizieren, wurde die 110 kDa-Bande mit drei säulenchromatographischen Schritten gereinigt. Der lösliche Extrakt aus dem Gewebe der Kaninchenleber wurde auf eine Anionenaustausch-Chromatographiesäule gegeben, es folgten eine Affinitätschromatographie und Gelfiltration. Das Substrat eluierte bei einem Molekulargewicht von ca. 450 kDa. Die Diskrepanz zwischen den 110 kDa bei der SDS-PAGE war zurückzuführen auf den denaturierenden Effekt des SDS, so dass erste Hinweise auf ein multimeres Enzym vorlagen. Die Sequenzanalysen bestätigten auch diese Vermutung: die native ACL liegt als Tetramer mit einem Molekulargewicht von 440 kDa vor; sie weist vier fast identische Untereinheiten von je 110 kDa auf.
Zusätzlich wurde die ACL durch Versuche mit ADP verifiziert. Nach Phosphorylierung der Kaninchenleber oder der gereinigten ACL mit [gamma-32P]ATP und EDTA verschwand das 110 kDa-Signal bei Zugabe von ADP im Gegensatz zu GDP, AMP und ATP.
Neben den proteinbiochemischen Methoden zum Auffinden eines Substrates wurden molekularbiologische Methoden in Verbindung mit dem Aufbau einer Zellkultur eingesetzt, um Einblicke in die strukturellen Aspekte der PHP zu erlangen. Über ein Baculovirus-Expressionssystem wurde das PHP-Gen in sf9-Zellen erfolgreich exprimiert und anschließend über eine Nickel-NTA-Säule gereinigt. Die rekombinante PHP war von seinen enzymatischen Aktivitäten vom nativen Enzym (gereinigt aus der Leber) nicht zu unterscheiden.
Analog zu diesem Vorgang wurden Mutanten exprimiert und gereinigt. Dieses waren im Einzelnen eine Mutation des Cystein(73) sowie die komplette Änderung des Nucleotid-Bindestellenmotivs ab der Aminosäure 75 (GxGxx[G/S]) in jeweils ein Alanin. Zusätzlich wurden zehn Aminosäuren am N- und C-Terminus deletiert. Die Aktivitätstests mit der ACL als Substrat zeigten folgendes Bild: neben dem exprimierten Wildtyp war nur die Mutation mit dem ausgetauschtem Cystein aktiv, d.h. Cystein(73) ist für die Enzymaktivität nicht essentiell. Anders dagegen die Befunde von den Deletionen und von den Mutationen des G-Motivs: PHP, der die 10 N-terminalen Aminosäuren fehlen, ist nicht enzymatisch aktiv. Wird bei der PHP die nucleotidbindende Sequenz mutiert, so führt dies ebenfalls zu einem Verlust der Enzymaktivität. Es konnten somit bereits drei Bereiche der PHP identifiziert werden, die für die Dephosphorylierung der ATP-Citrat Lyase entscheidend sind.
Mit dem hier erlangtem Wissen über die bedeutsamen Bereiche der Aminosäuresequenz der PHP können in der Zukunft weitere Erkenntnisse über Spezifität und Regulation gewonnen werden. Noch weiter gedacht, können über die biologischen Wirkungen der PHP pharmakologische Ansätze abgeleitet werden. Es ist durchaus realistisch, dass die PHP bald ein Zielprotein für die Arzneistoffentwicklung darstellt. Bei vielen Krankheiten wie Krebs, Diabetes und der rheumatoiden Arthritis spielen abnormale Phosphorylierungen der Proteine eine entscheidende Rolle. Mehr noch, manche Inhibitoren von bestimmten Phosphatasen sind bereits therapeutisch relevant. |
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| Descripció física: | 106 Seiten |
| DOI: | 10.17192/z2004.0334 |