Klonierung von Cytochrom P450-abhängigen Monooxygenasen aus Ammi majus L. und funktionelle Expression der Zimtsäure 4-Hydroxylase

Pflanzen reagieren auf Pathogenbefall mit einem komplexen System von physiologischen Reaktionen. Auslöser ist die Erkennung von Oberflächenstrukturen der Pathogene, die als Elicitoren wirken. Am Ende der Elicitor-induzierten Signaltransduktionskette steht die Aktivierung von Abwehrge...

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Main Author: Specker, Silvia
Contributors: Matern, Ulrich (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Doctoral Thesis
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2004
Subjects:
P
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Description
Summary:Pflanzen reagieren auf Pathogenbefall mit einem komplexen System von physiologischen Reaktionen. Auslöser ist die Erkennung von Oberflächenstrukturen der Pathogene, die als Elicitoren wirken. Am Ende der Elicitor-induzierten Signaltransduktionskette steht die Aktivierung von Abwehrgenen. Ein Teilaspekt ist dabei die Akkumulation von Phytoalexinen, im Falle der Apaiceae sind es Furanocunmarine. Aus Einbaustudien und in vitro-Messungen ist bekannt, dass an der Biosynthese der Furanocumarine mehrere Cyt P450 beteiligt sind, die durch Hefe oder pilzlichen Elicitor induziert werden können. Aus cDNA von Elicitor-induzierten Ammi majus-Zellkulturen wurden fünf Cyt P450 kloniert, deren Northern-Analyse ergab, dass drei davon auf transkriptioneller Ebene induzierbar sind, wobei AmCYP71AJ1 am deutlichsten induziert wird. Sequenz 1, CYP73A41, wurde funktionell als Zimtsäure 4-Hydroxylase identifiziert und biochemisch charakterisiert. Ihre Eigenschaften entsprechen im Wesentlichen den bereits klonierten C4Hs. Es bleibt die Identifizierung der anderen Cyt P450 durch Verbesserung und Kontrolle der Expression und Suche nach möglichen Substraten. Auf dem Wege zu einer Verbesserung der Expression wurde die NADPH-Cytochrom P450 Reduktase (CPR) kloniert mit dem Ziel eine simultane Expression der CPR und des zu untersuchenden Cyt P450 in Hefe durchzuführen. Im Sequenzvergleich weist Sequenz 2 (AmCYP71AJ1) auf der Ebene der Aminosäuren 66 % Ähnlichkeit zur Menthofuransynthase (MFS) aus Mentha x piperita (Q947B7, Bertea et al, 2001) auf. Da kein Menthofuran in Ammi majus beschrieben worden, ist es unwahrscheinlich, dass AmCYP71AJ1 die Bildung von Menthofuran katalysiert. Die Induktionsstärke und der Induktionsverlauf der relativen Transkriptmenge von AmCYP71AJ1 passen zu der Induktion der Marmesinsynthase-Aktivität, einem Cyt P450 der Psoralenbiosynthese. Vermutlich handelt es sich bei AmCYP71AJ1 um ein Enzym der unspezifischen Abwehr, eventuell sogar aus der Furanocumarinbiosynthese. Die Sequenz 3 (AmCYP98A21) ist auf Aminosäureebene zu 83 % identisch mit der Ocimum basilicum p-Cumaroyl Shikimat 3'-Hydroxylase und ist auf Transkriptiosnebene induzierbar. Die Sequenz 4 (AmCYP76B8) hatte 55 % identische Aminosäuren mit der Geraniol 10-Hydroxylase aus Catharanthus roseus. Der Northern-Blot zeigte im Gegensatz zur G10H aus Catharanthus roseus keine Induktion. Eine Zuordnung der nicht induzierten Sequenz 5 (AmCYP82H1) kann nicht erfolgen. Neben der wissenschaftlichen Grundlage haben die Untersuchungen auch praktische Bedeutung. Kenntnisse über die Biosynthese der Furanocumarine sind für den Menschen von Interesse. Es hat sich gezeigt, dass der Gehalt an Furanocumarinen in Sellerie aufgrund von saurem Nebel in kalifornischen Ballungsgebieten stark zunimmt, so dass die Konzentration über der Menge liegt, die beim Menschen nach Verzehr eine Dermatitis auslösen kann. Zudem wird eine solche Pflanze ungeniessbar für Insekten. Indem man regulierend in die Biosynthese eingreift, könnte man Sellerie herstellen, der keine Psoralene enthält, und somit auch in Gebieten mit grosser Luftverschmutzung angebaut werden kann.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2004.0072