Isolation und Charakterisierung der sporulationsspezifischen Protease LonB von Bacillus subtilis
Der Einsatz von Proteasen zur Regulation physiologischer oder genregulatorischer Prozesse ist bei Mikroorganismen ein weit verbreitetes Phänomen. Ein Großteil des proteolytischen Abbaus unterliegt dabei dem Energiestatus der Zelle. Im Genom von Bacillus subtilis sind zwei Mitglieder...
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| 1. Verfasser: | |
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| Beteiligte: | |
| Format: | Dissertation |
| Sprache: | Deutsch |
| Veröffentlicht: |
Philipps-Universität Marburg
2003
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| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | PDF-Volltext |
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| Zusammenfassung: | Der Einsatz von Proteasen zur Regulation
physiologischer oder genregulatorischer Prozesse ist bei
Mikroorganismen ein weit verbreitetes Phänomen. Ein Großteil
des proteolytischen Abbaus unterliegt dabei dem Energiestatus
der Zelle. Im Genom von Bacillus subtilis sind zwei Mitglieder
der Familie prokaryotischer ATP-abhängiger Serin-Proteasen
kodiert. Die erste, LonA, wird als Folge von Stresseinwirkung
wie Hitze, Ethanol-, osmotischem und oxidativem Stress und nach
Behandlung mit Puromycin verstärkt synthetisiert. Eine Rolle
bei der negativen Regulation der SigG-Aktivität unter
Bedingungen, die die Sporulation nicht induzieren, wird
vermutet. Das Gen der zweiten Protease, lonB, liegt direkt
upstream des lonA-Genes. In dieser Arbeit konnte gezeigt
werden, daß die Transkription von lonB der Kontrolle des ersten
Sigma-Faktors der Vorspore, SigF, unterliegt, und die
Expression auf dieses Kompartiment begrenzt ist.
DNA-Array-Analysen von Zellen, in denen die Expression sigF
artifiziell induziert wurde, zeigten einen deutlichen Anstieg
der Menge des lonB-Transkriptes, und durch Northern-Analyse
konnte ein monocystronisches Transkript nachgewiesen werden.
Fluoreszenz von Stämmen, die eine lonB-gfp-Fusion trugen, war
ausschließlich in der Vorspore zu detektieren und von der
Gegenwart des Transkriptionsfaktors SigF abhängig. Die
Transkription wurde an einem spezifischen Startpunkt initiiert,
der durch Primer-Extension-Analyse identifiziert werden konnte,
und vor dem Sequenzen liegen, die bekannten SigF-abhängigen
Promotoren gleichen. Sowohl LonB, als auch LonA, waren in
Zellextrakten des Wildtyps mit Hilfe spezifischer polyklonaler
Antikörper nachweisbar; LonB erschien ca. 90 min nach Beginn
der Sporulation, LonA war dagegen schon während des vegetativen
Wachstums zu beobachten. In vitro konnte die Peptidase- und
ATP-abhängige Protease-Aktivität beider Enzyme demonstriert
werden, zudem ist eine assoziierte ATPase-Aktivität sehr
wahrscheinlich. Die Inaktivierung von lonA und lonB durch
Insertion von Resistenzkassetten hatte keine Auswirkung auf den
Phänotyp vegetativer oder sporulierender Wildtyp-Zellen, und
auch die Transkription von Genen unter der Kontrolle der
Sporulations-Sigmafaktoren, SigF, SigG und SigK war in der
lonB-Mutante unverändert. Vergleichende 2D-Gel-Analyse zwischen
dem Wildtyp und lon-Mutanten lassen einen Einfluss der
LonB-Protease auf die Menge der mutterzellspezifischen
Serin-Protein-Kinase PrkA vermuten, der bedingt durch die
unterschiedliche Lokalisierung wahrscheinlich indirekt
ist. |
|---|---|
| DOI: | 10.17192/z2004.0068 |