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Rationales Enzymdesign zur Optimierung dimodularer Peptidsynthetasen
Die modular aufgebauten, multifunktionalen nichtribosomalen Peptid-synthetasen (NRPS) katalysieren in vielen Mikroorganismen die Produktion strukturell vielfältiger, pharmakologisch interessanter Naturstoffe. Für die Integration eines Bausteins in das wachsende Produkt ist jeweils ei...
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| 第一著者: | |
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| その他の著者: | |
| フォーマット: | Dissertation |
| 言語: | ドイツ語 |
| 出版事項: |
Philipps-Universität Marburg
2003
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| 主題: | |
| オンライン･アクセス: | PDFフルテキスト |
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| 要約: | Die modular aufgebauten, multifunktionalen
nichtribosomalen Peptid-synthetasen (NRPS) katalysieren in
vielen Mikroorganismen die Produktion strukturell vielfältiger,
pharmakologisch interessanter Naturstoffe. Für die Integration
eines Bausteins in das wachsende Produkt ist jeweils ein Modul
verantwortlich, welches seinerseits in einzelne Domänen
unterteilt werden kann. Diese Domänen katalysieren die
Erkennung, Aktivierung und den Einbau der Substrate.
Aufgrund
ihrer modularen Organisation stellen die NRPS ein geeignetes
System für die gezielte Entwicklung artifizieller Enzyme dar.
In dieser Arbeit wurden verschiedene Strategien der Domänen-
und Modulfusion verfolgt, um dimodulare Synthetasen für die
Produktion des Dipeptids alpha-Aspartyl-Phenylalanin (Asp-Phe),
das als Vorläufer in der Produktion des Zuckerersatzstoffs
Aspartam eingesetzt wird, zu entwickeln. Ein Vergleich von
sechs Asp-Phe-Synthetasen verdeutlicht die Auswirkungen von
künstlichen Fusionen auf die Aktivität der Enzyme. So konnten
deutliche Unterschiede in der Umsatzrate sowie die von der
Umsatzrate abhängige Synthese des Nebenprodukts beta-Asp-Phe
beobachtet werden. Durch den Vergleich verschiedener
Fusionsstrategien am Beispiel der Asp-Phe-Synthetasen konnte
das Wissen über das Design hybrider Peptidsynthetasen erweitert
werden.
Die strukturelle Vielfalt nichtribosomal
synthetisierter Peptide wird nicht zuletzt durch die Katalyse
von modifizierenden Domänen gewährleistet. Eine spezielle
Domäne ist die Heterozyklisierungs-(Cy)-Domäne. Sie katalysiert
neben der Bildung einer Peptidbindung die Zyklisierung der
Seitenkette von Cystein, Serin oder Threonin zu Thiazolin- bzw.
Oxazolin-Ringen. In dieser Arbeit wurde, basierend auf den
ersten beiden Modulen der Bacitracin-Synthetase A, ein
Modellsystem zur Untersuchung der Cy-Domäne entwickelt, welches
das heterozyklische Isoleucinyl-Thiazolinylcystein bildet.
Ausgehend von diesem Modellsystem konnten durch Modulfusionen
dimodulare Hybridsynthetasen konstruiert werden, deren
Fähigkeiten, neue heterozyklische Produkte zu bilden, das
biokombinatorische Potential der Cy-Domäne verdeutlichen.
Zusätzlich konnte durch Mutation von konservierten Resten
innerhalb der Cy-Domäne des Modellsystems die Reaktionsabfolge
von Peptidbindungsbildung und Zyklisierung aufgeklärt werden.
Anhand der erhaltenen, mutierten Synthetasen, die nur noch die
Bildung der Peptidbindung aber nicht die nachfolgende
Zyklisierung katalysieren, konnte der Beweis für die
Unabhängigkeit von Kondensations- und
Heterozyklisierungsreaktion innerhalb der Cy-Domäne erbracht
werden. |
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| DOI: | 10.17192/z2004.0067 |